基于流式細胞術和K-mer方法測定6種槭屬植物基因組大小

馬秋月，王玉虓，李倩中*,李淑順，聞 婧，朱 璐，顏坤元，杜一鳴，解志軍，李淑嫻，歐陽芳群，魯成代

(1.江蘇省農業科學院休閑農業研究所,江蘇 南京 210014；2.南京林業大學林學院，南方現代林業協同創新中心,江蘇 南京 210037；3.襄陽市林業科學技術推廣站,湖北 襄陽 441000；4.北京市植物園，北京 100093；5.天水市五小葉植物保護研究所，甘肅 天水 741000)

槭屬(Acer)隸屬于無患子目(Sapindales)槭樹科(Aceraceae),全世界約有200多種，我國就有151種，是槭樹分布種類最多的國家[1]。槭屬植物樹姿優美，葉形秀麗，不同季節葉色變異豐富，是園林綠化及景觀營建中極具代表性的重要觀賞樹種，亦是優良的盆景樹種。此外，部分槭屬植物除具有觀賞價值外，還具有油用、藥用、材用、化工用等多種用途，如元寶楓(Acertruncatum)[2]、青楷槭(A.tegmentosum)[3]等。因此，該屬植物在未來的食品、醫療及化工等領域開發應用前景廣闊。

以往研究者們主要對槭屬植物的栽培與育種領域進行相關研究[4-7]，近年來該屬植物的分子生物學特性如分子標記開發、葉色變異及代謝產物合成機制相關研究也逐漸受到關注[2,8-9]?；蚪M特征研究是植物基因資源開發和分子機制研究的前提，其中基因組大小測定是進行物種全基因組測序、遺傳資源開發與利用等的基礎[10-12]。關于不同種槭樹基因組大小及特征研究的報道較少，嚴重阻礙了該屬植物分子生物學研究。

植物基因組大小(又稱DNAC值)是指一個物種單倍體核的DNA含量，一般用質量(pg)或核苷酸堿基對數目(Mb)來表示(1pg約978 Mb)[10-12]?；蚪M大小測定方法主要包括基于K-mer分析的基因組測序法[13]、流式細胞術[14]以及孚爾根微顯影法[15]，前兩者是測定基因組大小的常用方法，其中基于K-mer分析的基因組測定法具有高通量測序、速度快、數據量大等優點[2]，流式細胞術法具有操作簡單、分辨率高、準確率高等優點[10,14,16-17]。

已知的槭屬植物多為二倍體(2n=2x=26)[18]，但不同種間具有不同大小的基因組。近年來，隨著高通量測序技術的快速發展，測序成本大幅度降低，使得大量的非模式樹種如銀杏(Ginkgobiloba)[16]、簸箕柳(Salixsuchowensis)[19]、鵝掌楸(Liriodendronchinense)[20]等的全基因組測序工作得以開展。目前僅19種槭樹科植物的基因組大小被收錄于植物DNAC值數據庫(https://cvalues.science.kew.org)，平均大小為0.90 pg，其中最大的DNA 1C值為1.70 pg，最小的為0.4 pg。本研究采用流式細胞術和基于K-mer 分析的基因組Survey測序對槭屬植物中的建始槭(A.henryi)、秀麗槭(A.elegantulum)、五小葉槭(A.pentaphyllum)、青楷槭、血皮槭(A.griseum)、三角楓(A.buergerianum)進行基因組大小測定，以期為該屬植物的倍性研究、功能基因組學分析以及遺傳改良等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料三角楓、秀麗槭、建始槭的嫩葉采自江蘇省南京市溧水區江蘇省農業科學院槭樹良種基地(119°02′E，31°65′N),青楷槭嫩葉采自吉林省白山市二道區(128°08′E，42°27′N),五小葉槭嫩葉采自甘肅省天水市(104°10′E，34°55′N),血皮槭嫩葉采自中國林業科學研究院(116°24′E，40°00′N)。用于流式測定內標植物的玉米(Zeamays‘CE-777’)和大豆(Glycinemax‘Polanka’)由南京林業大學林木遺傳與生物技術重點實驗室提供。

1.2 流式細胞術試驗檢測方法

1.2.1 解離液的篩選與熒光染料的制備

以6種槭樹和內標植物嫩葉為試材，分別將6種解離液WPB、GPB、Tris-MgCl2、LB01、Galbraith’s、Otto進行逐一測試。其中所用熒光染料碘化丙啶(PI)配制后(50 μg/mL)避光保存于4 ℃冰箱。

1.2.2 細胞核懸液制備與DNA特異性染色

細胞核懸液制備參照馬秋月等[7]的方法：將待測樣品植株分別稱取新鮮幼嫩的葉片3份(每份約1 g)放置于培養皿，加入4 ℃預冷的1.5 mL 解離液，用刀片迅速切碎，將解離液經37 μm濾膜過濾至1.5 mL EP管中，冰上孵育5 min，1 000 r/min離心5 min后棄上清，再將150 μL預冷的解離液加入收集的沉淀細胞中，吸取250 μL渦旋混勻后的混合液，并加入0.5 μL預冷的PI熒光染料，混勻后置于4 ℃冰箱避光染色15 min后上機檢測。對照樣品玉米和大豆的細胞核懸液的制備方法同上。將對照樣品與待測樣品的細胞核懸液等體積混合。

1.2.3 流式細胞儀測定與基因組大小計算

測定前，將流式細胞儀(BD InfluxTM，USA)預熱30 min，采用488 nm藍光激發，收集670/30 FL2 通道的熒光；依據碘化丙啶(PI)嵌入量與細胞核DNA成正比關系，通過測定的熒光強度，進而計算DNA的相對含量。采用FACSTMSortware 1.0.0.650軟件進行相關樣品的統計分析與圖像繪制。其中測試樣品低速收集8 000～10 000個顆粒[每個樣品進行3次平行實驗，變異系數(CV)均控制在5%以內[21]]，本試驗所有的待測樣品峰為P4，內標峰均為P5峰。核DNA含量的計算方法為：待測樣核DNA含量(pg)=對照樣本細胞核DNA含量×(待測樣本G0與G1期峰熒光強度之比/對照樣本G0與G1期峰熒光強度之比)；其中，G0為分裂停止期，G1為細胞DNA復制未開始期。已知內標物種玉米和大豆的2C基因組大小為 5.43 pg和2.50 pg。

1.3 K-mer分析法測定基因組大小

1.3.1 基因組DNA提取與序列測序

采用北京艾萊德植物基因組DNA提取試劑盒(DN14)提取DNA[22]，利用Nanodrop 2000 分光光度計(德國，Eppendrof)和1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳進行DNA濃度和質量檢測。合格的DNA樣品經過隨機打斷后(長度為350 bp)構建文庫，并利用Illumina HiSeqTMXten測序平臺進行高通量測序。獲得的原始數據經過質控過濾后(去除接頭、污染和低質量reads)進行K-mer分析。

1.3.2 基因組大小計算與雜合度分析

利用SOAPdenovo軟件 (https://github.com/aquaskyline/SOAPdenovo 2)進行數據拼接與組裝，采用K-mer分析法[15]估算6種槭屬植物基因組的大小、雜合度、重復比例。根據基因組大小等于K-mer總數與K-mer期望深度的比值，即可估測出待測樹種的基因組大小。此外，分別根據K-mer曲線的分布情況以及標準泊松分布與實際數據曲線峰值后的面積差值，計算獲得雜合率(雜合峰值與純合峰值的比值)及重復序列比例。本試驗基于K值為17進行預測，并利用Jellyfish 2.1.4軟件[23]進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 細胞解離液的篩選

細胞解離液促使植物細胞破碎后分散細胞器，從而解離出細胞核，但不同植物在不同解離液作用下，其解離效果差異較大[14,17,24]。本研究以6種槭樹嫩葉為實驗材料，比較6種解離液(LB01、WPB、GPB、Gal、Otto、Tris-MgCl2)的解離效果后發現，WPB的解離效果最好(圖1和圖2)，待測樣品和內標的粒子清晰集中，基本無重疊峰和雜峰，且區分度良好，能夠將待測和內參實驗樣品區分開；因此，WPB是本研究中流式測定體系的最佳解離液。

圖1 6種槭樹與內標混合樣品散點圖Fig.1 The scatter plots of the mixed cell nucleus suspensions of six Acer species

A—E的內標為大豆，F的為玉米。The internal standard of A-E is Glycine max ‘Polanka’,and that of the F is Zea mays CE-77.圖2 6種槭樹與內標混合樣品流式細胞儀檢測結果Fig.2 The result of mixed samples of six Acer species and internal standard

2.2 流式細胞儀測定的基因組大小

通過內標法對6種槭樹的混合細胞核懸液樣品PI發射的熒光強度進行流式測定分析。由圖2可知，待測樣品與內標間區分度良好，且DNA含量CV均在5.0%以內，試驗結果可靠穩定[17,24-25]。已知大豆1C基因組大小為1.25 pg，根據待測樣品與大豆峰值的倍數關系，以大豆為內標能成功檢測出待測樣品基因組大小。通過3次平行重復檢測后，5種槭樹樣品平均基因組大小分別為建始槭(691.12±8.69) Mb、三角楓(863.90±8.69) Mb、秀麗槭(896.50±4.35) Mb、血皮槭(893.24±8.69) Mb、五小葉槭(766.10±8.69) Mb。然而以大豆為內標顯示其與青楷槭會出現主峰相近或部分重疊，但以玉米(1C基因組大小為2.72 pg)為內標，成功測出青楷槭的基因組大小為(1 154.04±13.04) Mb(表1)。由表1可以看出，6種槭樹科植物的基因組大小存在一定的差異。

表1 6種槭屬植物基因組大小Table 1 Genome size survey for six Acer species

表1 (續)

2.3 K-mer分析法測定的基因組大小

基于高通量測序平臺Illumina HiSeqTMXten 分別對6種槭樹進行測序，經過過濾及質控評估后，文庫Q20(錯誤率為1%)均在96%以上，Q30(錯誤率為0.1%)在92%以上，錯誤率均不高于0.04%，表明序列質量較好(表2)。

表2 測序數據統計及質量評估Table 2 Sequencing data statistics and quality assessment

利用Jellyfishv 2.1.4軟件對上述6種高質量測序數據進行K-mer分析(K值為17)。從圖3可以看出，K-mer分布曲線成峰較好，除五小葉槭和青楷槭外，其他均呈雙峰分布。其中建始槭的17-mer期望深度(圖中主峰)分別在21和44附近，三角楓和秀麗槭在15和32附近，血皮槭在17和35附近；而五小葉槭和青楷槭為單峰分別在35和22附近。依據公式，基因組大小等于K-mer總數與K-mer期望深度的比值，本研究估測及修正后6種槭樹的基因組大小分別為建始槭(561.72 Mb)、三角楓(743.0 Mb)、秀麗槭(777.87 Mb)、血皮槭(771.51 Mb)、五小葉槭(650.64 Mb)、青楷槭(1 103.46 Mb)。如圖3所示，前四者的主峰1/2位置處均有明顯的雜合峰，說明均存在雜合現象，而后兩者雜合峰不明顯；通過預估建始槭、三角楓、秀麗槭、血皮槭、五小葉槭、青楷槭的雜合率分別為1.00%、1.24%、1.31%、1.08%、0.28%、0.81%。此外，還發現主峰后均存在拖尾現象，分析發現其重復率分別為58.10%、63.83%、66.44%、67.44%%、63.73%、76.82%，研究發現6種槭樹基因組的確存在較復雜的基因組重復序列(表3)。

圖3 6種槭樹基因組的17-mer曲線分布Fig.3 Distribution of 17-mer in the genomes of six Acer species

表3 基于17-mer的6種槭樹基因組分析Table 3 The 17-mer analysis of six Acer species

3 討 論

3.1 基因組大小測定方法的比較

本研究首次通過對6種常用解離液的篩選和比較，建立和篩選建始槭、三角楓、秀麗槭、血皮槭、五小葉槭、青楷槭的最適解離液，結果發現以WPB為細胞核解離液時沒有重疊峰，且區分度良好，所獲得的粒子清晰集中，CV值均可控制在5%以內，保證了該研究的準確性和可靠性。不同植物材料其最適解離液具有較大差異，如已報道的銀縷梅屬中的銀縷梅(Parrotiasubaequalis)和波斯鐵木(P.persica)以WPB作為細胞解離液效果較好，而解離液Galbraith’s對蘭屬植物中的對蓮瓣蘭(Cymbidiumtortisepalum)和墨蘭(C．sinense)解離效果最好[27]；然而同屬植物間也存在一定差異，以往研究中發現槭屬植物中的雞爪槭(A.palmatum)和元寶楓(A.truncatum)以LB01為解離液時效果最好[14]。這樣的結果表明不同解離液對不同植物材料的解離效果存在很大差異[24-25]，不同解離液中化學成分的差異性以及植物組織表現出的不同細胞特異性等是其解離效果差異的主要原因。

用于檢測基因組大小的方法主要包括流式細胞術、孚爾根光密度測量法、實時熒光定量PCR、基于基因組測序的K-mer分析法等[14,25-26]。目前因高通量測序平臺結合K-mer分析也已成熟地應用于不同植物基因組大小的估測[17,25]，如鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)[28]、黃瓜(Cucumissativus)[29]、人參(Panaxginseng)[30]等。

本研究基于Illumina HiSeqTMXten平臺分別對6種槭樹植物的基因組大小進行K-mer分析，結果顯示，6種槭樹的基因組大小分別為建始槭(561.72 Mb)、三角楓(743.00 Mb)、秀麗槭(777.87 Mb)、血皮槭(771.51 Mb)、五小葉槭(650.64 Mb)、青楷槭(1 103.46 Mb)?；诹魇郊毎麅x測定的結果分別為：建始槭[(691.12±8.69) Mb]、三角楓[(863.90±8.69) Mb]、秀麗槭[(896.50±4.35) Mb]、血皮槭[(893.24±8.69) Mb]、五小葉槭[(766.10±8.69) Mb]、青楷槭[(1 154.04±13.04) Mb]。兩種方法預測后6種槭樹均為二倍體，K-mer分析結果均略小于流式細胞術預測結果，與以往報道中對波斯鐵木(Parrotiapersica)[25]、繡球 (hydrangeamacrophylla)[17]、黃瓜[29]和人參[30]等植物的基因組大小研究結果類似。但不同植物間也存在一定差異，如在鐵皮石斛[28]、新疆沙冬青 (Ammopiptanthusmongolicus)[26]中K-mer的分析結果略大于流式細胞測定的基因組大小，其主要原因是流式細胞測定會受到植物細胞結構及其次生代謝產物的影響，而基于K-mer的分析可克服植物內源性物質的干擾[29-30]，但在未來開展植物全基因組的測定工作中，二者的比較和分析具有重要的參考價值。

3.2 槭樹科植物基因組大小的比較

一般體細胞DNA的含量用2C代表[31]。植物基因組大小作為生物多樣性的主要特征參數之一，在比較基因組學、進化分析、生態學等研究領域中都具有重要意義[10-12]。Soltis等[32]將被子植物基因組大小劃分為DNA 1C值≤1.4 pg 為極小基因組，1C值≥1.4～3.5 pg的為小基因組。鵝耳櫟葉槭 (A.carpinifolium)為首次被報道基因組大小的槭屬植物，其基因組大小為0.38 pg[33]，此后陸續有研究者對不同槭樹基因組大小進行測定與評估，發現不同品種的基因組大小差異較大。盡管槭樹種類超過200多種，但目前僅19種槭樹科植物的基因組大小數據被植物DNAC值數據庫(https://cvalues.science.kew.org)所收錄。除美國紅楓(A.rubrum)DNA 1C值為1.70 pg外，其余品種均小于1.4 pg，屬于極小基因組[32]，最小的樟葉槭(A.coriaceifolium)僅0.4 pg。

槭屬植物的種類繁多，已有研究表明該屬植物基因組大小存在一定差異，說明經過長期的自然選擇，其遺傳變異較為豐富。盡管本研究中6種槭樹均為二倍體，不同槭樹的基因組大小也存在一定差異，如青楷槭的基因組大小約為建始槭的2倍。以往研究報道基因組內大量的非編碼DNA，基因組多倍化和轉座子的積累是基因組增大的內在主要動力[33-34]，是導致不同植物基因組大小產生差異的主要原因。已有研究表明，植物的多樣性及物種滅絕的風險性與植物基因組的大小有一定的關系[35]。該現象在其他物種中也極為普遍，例如棗屬(Ziziphus)[36]、草莓屬(Fragaria)[37]等。

本研究篩選出適合6種槭樹流式測定的最佳細胞核解離液為WPB，且以玉米和大豆為內標，基于流式細胞術成功區分并估測6種槭樹的基因組大小，同時利用K-mer分析法成功分析6種槭樹的基因組特征。以往將K-mer分析預測的雜合度大小一般分為兩種，分別為微雜合(0.5%≤雜合率<0.8%)和高雜合(雜合率≥0.8%)[38]。本研究中五小葉槭的雜合度最低為0.28，屬于低雜合；青楷槭為0.81近于微雜合，其余為高雜合基因組植物。此外，基因組重復序列比例≥50%被認為是高重復基因組，研究結果表明6種槭樹重復序列均在58%以上，這為后續基于第3代全基因組測序工作的開展增加了難度[25,28,39]。本研究首次成功測得6種槭樹植物的基因組大小，補充和豐富了槭樹科植物的DNAC值數據庫，為槭屬植物的細胞學、基因組學以及系統進化等研究奠定了理論基礎。