轉基因小黑楊根際土壤微生物群落特征研究

王 陽，王 偉，姜 靜，顧宸瑞，楊蘊力

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業大學)，黑龍江 哈爾濱 150040)

我國楊樹基因工程始于20世紀80年代末，繼選育獲得首例抗蟲轉基因歐洲黑楊(Populusnigra)后[1]，抗蟲轉基因毛白楊(P.tomentosa)、美洲黑楊(P.deltoides)、小黑楊(P.simonii×P.nigra)等陸續培育成功[2]。此外，楊樹抗旱、耐鹽或抗病等基因工程育種研究也取得了一定的成效，相繼獲得了不同轉基因株系。這些轉基因楊中僅有轉抗蟲歐洲黑楊獲批商品化[3],大多數轉基因楊樹還處于中間試驗或環境釋放試驗階段，該階段的主要研究內容之一就是進行轉基因楊的環境生態安全性評價[4-8]。其中，轉基因楊樹對根際微生物數量及群落組成產生的影響愈發引起研究者們的重視。

轉基因植物在生長發育過程中通過根系與土壤進行著頻繁的物質交換，作為土壤生態系統重要組成部分的土壤微生物，尤其是根際微生物則極有可能受到影響。前人對其他轉基因植物的研究發現部分轉基因植物會通過根系殘茬或分泌物對周圍土壤產生一定影響，如抑制土壤中某些微生物生長的同時促進另一些微生物的生存與繁殖，致使土壤中營養成分發生改變與轉化，從而使土壤最適宜于植物的生長[9]；在關于磷高效轉基因水稻(Oryzasativa)連續種植對土壤微生物影響的研究中發現，土壤微生物多樣性確實受到了影響，但這種影響主要因施肥條件和植株發育時期的不同而變化[10]。另一方面，一些研究也發現轉Bt基因玉米(Zeamays)和棉花(Gossypiumhirsutum)與非轉基因植株相比，土壤微生物多樣性及其活性沒有顯著差異[11-12]。

對轉基因楊樹根際微生物研究顯示，轉抗蟲基因歐洲黑楊、轉Bt基因‘南林895’楊(Populusdeltoides×P.euramericana‘Nanlin 895’)、轉DREB毛白楊、轉基因庫安托楊(Populus×euramericana‘Guariento’)等楊樹在外源基因導入后對根際細菌或真菌群落組成幾乎沒有影響或影響非常有限[13-19]。例如，轉PeTLP基因‘南林 895’楊根際土壤中的細菌、真菌及放線菌數量在不同月份的變化趨勢基本一致，且不同微生物的數量在轉基因株系與非轉基因株系之間的變化趨勢也基本保持一致，轉基因楊樹與非轉基因楊樹之間土壤微生物的菌落數量間無顯著性差異[20]；7年生轉Bt基因歐洲黑楊林地和土壤微生物數量調查顯示，轉基因植株根系與非轉基因植株根系的土壤細菌、放線菌和霉菌數量無顯著差異，轉基因林地與非轉基因林地間的土壤細菌、放線菌和霉菌數量也無顯著差異[6]。

小黑楊(Populussimonii×P.nigra)是黑龍江省的主要人工造林樹種之一，為了擴大其種植范圍，提高在鹽堿及干旱地區造林成活率，東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室姜靜教授研究團隊自2001年開始，采用基因工程育種技術先后獲得了轉betA基因[21]、轉LEA基因[22]及轉WRKY70基因的小黑楊[3]。研究顯示，betA基因及LEA基因在植物基因組中過表達后，能夠顯著提高植物甜菜堿、晚期胚胎蛋白的表達量，進而通過滲透調節提高植物的抗旱耐鹽性[23-25]。WRKY70基因屬于WRKY轉錄因子超家族第Ⅲ類亞家族成員，在植物的生物及非生物脅迫中均起著至關重要的作用，PsnWRKY70轉錄因子在鹽脅迫應答信號轉導網絡中具有負調控作用，PsnWRKY70干擾表達小黑楊其耐鹽性顯著高于對照株系[3]。目前，通過轉基因小黑楊的中間試驗初步選擇獲得了生長適應性好的優良株系，是后續推廣應用的首選轉基因株系[26-28]。為了解上述轉基因小黑楊對土壤微生物產生的影響，試驗以轉TaLEA、betA、WRKY70基因小黑楊根際土壤為試材，分析其根際土壤細菌及真菌群落組成特征，明確轉基因活動對小黑楊根際群落微生物的影響，為后續的推廣應用和產業化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

研究地點位于黑龍江省哈爾濱市東北林業大學育種基地(126°64′E，45°72′N)，屬中溫帶大陸性季風氣候，全年平均氣溫5.6 ℃，最熱月平均氣溫23.6 ℃，最冷月平均氣溫-15.8 ℃，平均年降水量569.1 mm，主要降水月份為6—9 月，無霜期168 d。

1.2 試驗材料

試驗所用材料分別為：轉TaLEA、轉betA、轉WRKY70-RNAi(圖表中相應簡稱為TaLEA、betA、WRKY70)小黑楊及野生型(WT)小黑楊根際土壤。

2018年4月初分別采集參試小黑楊當年生枝條，剪切長度為12 cm左右的插穗，于溫室中進行扦插，基質為V草炭土∶V河沙∶V黑土= 2∶2∶1，5月中旬待插穗生根、展葉后，每個株系選擇生長一致的30株小苗，移栽于30 cm(高)×36 cm(徑)花盆中，基質為V草炭土∶V河沙∶V黑土=2∶1∶1，每個花盆中加入等量基質，盆下放置塑料托盤，置于東北林業大學育種基地進行常規管理。

2020年6月中旬，選取株高為(190±5)cm的健康株系，各轉基因小黑楊及野生型小黑楊分別選3株，共計12株苗木。分別采集植株根系，抖落較松散的土壤，將每種轉基因小黑楊及野生型小黑楊的3株植株的根系分別進行混樣，隨后置于裝有質量分數0.85% NaCL無菌溶液的三角瓶中，200 r/min震蕩15 min，取出根系得到土壤懸濁液，將每組土壤懸濁液3等分，即為3次重復。每次取懸濁液于2 mL離心管中，4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，棄上清，反復5～6次進行懸濁液離心，將獲得的土壤放入-80 ℃冰箱保存備用。采用QIAGEN公司的DNeasy PowerSoil Kit試劑盒提取土壤微生物總DNA。

將得到的DNA樣品送至上海派森諾生物科技有限公司進行擴增，根際細菌擴增區域為V3—V4區，采用正向引物(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，擴增片段大小為500 bp；根際真菌擴增區域為ITS1區，采用正向引物(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和反向引物(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)，擴增片段大小為280 bp。25μL的擴增體系中加入：5×反應緩沖液5 μL，5×GC buffer 5 μL，2 μL 2.5 mmol/L的 dNTP，1 μL 10 μmol/L的正向引物，1 μL 10 μmol/L的反向引物，2 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。擴增參數為98 ℃ 2 min；98 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25～30個循環；72 ℃ 5 min。擴增完成后進行細菌16SrRNA、真菌ITS建庫及高通量測序。

1.3 數據處理

用DADA2法[29]進行去引物，質量過濾，去噪(denoise)，拼接和去嵌合體等。此法不再以相似度聚類，只進行去重(dereplication)，即相當于以100%相似度聚類。質控后產生的每個去重序列稱為ASVs (amplicon sequence variants，即特征序列)。用QIIME2 (2019.4)進行Alpha多樣性、物種組成及差異分析。

用Excel、Origin 9.0、Heml等軟件進行數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 土壤細菌及真菌樣品測序深度評估

根據轉不同基因小黑楊及野生型小黑楊的根際土壤細菌及真菌稀釋曲線(圖1)，可知隨著測序深度的增加，細菌及真菌稀釋曲線逐漸趨于平緩，可觀察的ASVs變化不大，說明測序數據量合理，能夠真實反映土壤細菌及真菌的群落組成。

圖1 參試小黑楊根際土壤細菌及真菌稀釋曲線Fig.1 Rare faction curve of bacteria and fungi in rhizosphere soil of Populus simonii × P. nigra

2.2 根際土壤細菌、真菌群落豐度和Alpha多樣性變化

土壤樣品微生物群落Alpha多樣性指數如表1所示。覆蓋度(coverage)為測序深度指數，數值越高則說明樣品中序列被測出的概率越高，參試樣品細菌及真菌的覆蓋度均在97%以上，表明絕大部分細菌及真菌種群被測出，測序結果可以反映根際土壤細菌及真菌群落多樣性變化(表1)。

觀察到的物種數(observed species)和Chao1指數是估算細菌、真菌群落豐度的參數，而Shannon和Simpson指數是估算群落多樣性的參數。由表1可知，參試的轉TaLEA、轉betA、轉WRKY70小黑楊及WT小黑楊，根際土壤細菌及真菌群落豐度、多樣性不盡相同。在細菌群落豐度方面，轉TaLEA、轉betA小黑楊與WT小黑楊根際土壤細菌群落豐度無顯著差異，而轉WRKY70小黑楊顯著低于WT小黑楊根際土壤細菌群落豐度(P<0.05)；在細菌群落多樣性方面，轉TaLEA小黑楊與WT小黑楊差異不顯著，而轉betA及轉WRKY70小黑楊均顯著低于WT小黑楊(P<0.05)。

表1 參試小黑楊根際土壤細菌及真菌Alpha 多樣性分析Table 1 Alpha diversity of bacteria and fungi in rhizosphere soil of Populus simonii × P.nigra

根際真菌群落豐度及多樣性分析顯示，3種轉基因小黑楊的真菌群落豐度及多樣性均顯著低于WT小黑楊(P<0.05)。

2.3 根際土壤細菌及真菌群落結構差異性分析

基于參試小黑楊根際土壤細菌和真菌的ASV(特征序列)分別繪制了韋恩圖(圖2)。由圖2可知，在根際土壤細菌方面，WT、TaLEA、betA和WRKY70 4組樣品中特有的ASV數量分別為4 823、4 985、4 027和4 148個，各占總數的21.9%、22.6%、18.2%和18.8%。其中參試小黑楊共有的ASV有824個，占總數的3.7%，說明各組樣品間ASV存在差異。根據與WT小黑楊共有ASV數量分析顯示，與WT小黑楊根際土壤細菌群落相似程度最高的是轉TaLEA小黑楊(1 996個)，其次是轉betA小黑楊(1 836個)，相似度最小的是轉WRKY70小黑楊(1 344個)。

圖2 參試小黑楊根際土壤細菌及真菌的ASV韋恩圖Fig.2 ASV Venn diagram of bacteria and fungi in rhizosphere soil of Populus simonii × P. nigra

在根際土壤真菌方面，WT、轉TaLEA、betA和WRKY704組樣品中特有的ASV分別為501、243、179、308個，分別占總數的27.6%、13.4%、9.9%、17.0%。參試小黑楊共有的ASV有163個，占總數的9.0%，同樣說明各組樣品間ASV存在差異。根據與WT小黑楊共有ASV數量分析表明，與WT小黑楊根際土壤真菌群落相似度最高的是轉TaLEA小黑楊(331個)，其次是轉betA小黑楊(273個)及轉WRKY70小黑楊(273個)。

為了進一步比較樣本間的根際土壤細菌及真菌屬水平組成差異，用平均豐度位于前50屬的豐度數據繪制了聚類熱圖(圖3)，結果顯示，在根際土壤細菌及真菌群落組成上，轉TaLEA小黑楊與WT小黑楊更接近，轉betA小黑楊與轉WRKY70小黑楊更接近，這也與PCA(圖4)結果相符。

A:Gemmatimonas.芽單胞菌屬；Rhodanobacter.產黃桿菌屬；Lactobacillus.乳(酸)桿菌屬；Sphingomonas.鞘氨醇單胞菌屬；Pseudomonas.假單胞菌屬；Arenimonas.砂單胞菌屬；Novosphingobium.新鞘氨醇桿菌屬；Flavobacterium.黃桿菌屬；Phenylobacterium.苯基桿菌屬；Hyphomicrobium.生絲微菌屬；Pseudolabrys.假雙頭斧形菌屬；Amycolatopsis.擬無枝酸菌屬；Devosia.德沃斯氏菌屬；Bradyrhizobium.慢生根瘤菌屬；Nocardioides.類諾卡氏屬。測序結果未能將Subgroup_7、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Subgroup_6、Subgroup_2準確歸類。Saccharimonadales、Ellin6067、SC-I-84、Occallatibacter、Bryobacter、Candidatus_Solibacter、KD4-96、Ramlibacter、IMCC26256、MND1、IS-44、Haliangium、Dokdonella、Mucilaginibacter、Rhizobacter、Granulicella、GOUTA6、Bauldia、Dongia、Jatrophihabitans、67-14、Reyranella、Acidibacter、Candidatus_Koribacter、A4b、SWB02、WPS-2、Micropepsis、Chloroplast、Rhodovastum尚未確定中文名稱。B:Tomentella.棉革菌屬；Clavulina.鎖瑚菌屬；Neurospora.鏈孢霉屬；Pseudogymnoascus.假裸囊菌屬；Mrakia.木拉克酵母屬；Coniochaeta.錐毛殼屬；Penicillium.青霉屬；Byssochlamys.絲衣霉屬；Talaromyces.踝節霉屬；Paecilomyces.擬青霉屬；Fusarium.鐮刀菌屬；Trichoderma.木霉屬；Pseudeurotium.假散囊菌屬；Plenodomus.豐屋菌屬；Inocybe.絲蓋傘屬；Hebeloma.粘滑菇屬；Sphaerosporella.小球孢盤菌屬；Geopora.地孔菌屬；Laccaria.蠟蘑屬；Didymella.亞隔孢殼屬；Cadophora.背芽突霉屬；Thanatephorus.亡革菌屬；Aureobasidium.短梗霉屬；Galerina.盔孢傘屬；Plectosphaerella.小不整球殼屬；Mycosphaerella.球腔菌屬；Filobasidium.線黑粉菌屬；Mortierella.被孢霉屬；Epicoccum.附球霉屬；Paraglomus.類球囊霉屬；Leptosphaeria.小球腔菌屬；Rhodotorula.紅酵母屬；Aspergillus.曲霉屬；Peziza.盤菌屬；Gibberella.赤霉屬；Alternaria.鏈格孢霉屬；Septoria.殼針孢屬；Olpidium.油壺菌屬。Serendipita、Capronia、Protostropharia、Fibulochlamys、Archaeorhizomyces、Paraphaeosphaeria、Cystofilobasidium、Ceratobasidium、Echria、Naganishia、Tausonia、Neoascochyta尚未確定中文名稱。Z值為該樣品在屬分類水平的相對豐度與所有樣品在該水平的平均相對豐度的差除以所有樣品在該水平上的標準差所得到的值。Z value represents the data obtained by dividing the difference between the relative abundance of the sample at the genera classification level and the average relative abundance of all samples at that level by the standard deviation of all samples at that level.圖3 參試小黑楊根際土壤細菌及真菌群落屬水平排序前50的豐度聚類熱圖Fig.3 Cluster heat map at genus level(top 50) of abundance of bacteria and fungi in rhizosphere soil of Populus simonii × P.nigra

主成分分析(PCA)顯示，PC1和PC2對根際土壤細菌群落結構的貢獻率分別為54.1%和24.8%(圖4A)，累積貢獻率為78.9%，認為是造成細菌群落結構變化的主要來源；同時在根際土壤真菌群落PCA分析中，PC1和PC2的貢獻率分別為63.9%和21.6%(圖4B)，累積貢獻率為85.5%，說明這兩個主成分可以解釋真菌群落差異。結合圖2可知，無論是根際土壤細菌群落結構還是真菌群落結構，轉TaLEA小黑楊與WT小黑楊的群落差異較小，而轉WRKY70小黑楊與WT小黑楊的群落差異相對較大。

圖4 參試小黑楊根際土壤細菌及真菌群落屬水平主成分分析Fig.4 PCA(principal component analysis) at genus level of bacteria and fungi communities in rhizosphere soil of Populus simonii × P.nigra

2.4 根際土壤細菌及真菌群落組成分析

小黑楊根際土壤樣品細菌群落結構在門水平和屬水平排序前20的相對豐度見圖5、圖6。

圖5 參試小黑楊根際土壤細菌、真菌群落門分類水平排序前20的相對豐度Fig.5 Relative abundance at phylum level(top 20) of bacteria and fungi in rhizosphere soil of Populus simonii × P. nigra

圖6 參試小黑楊根際土壤細菌、真菌群落屬分類水平排序前20的相對豐度Fig.6 Relative abundance at genus level(top 20) of bacteria and fungi in rhizosphere soil of Populus simonii × P. nigra

由圖5可知，門水平上主要包括由變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、Patescibacteria和綠彎菌門(Chloroflexi)(圖5A)，占細菌總數的 96.37%～96.54%，其中變形菌門為優勢菌門，占細菌總數的44.78%～53.00%。在4個參試樣品中，WT與TaLEA根際細菌群落結構在門水平更接近，betA與WRKY70更接近。真菌群落結構在門水平上則是擔子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)為優勢菌門(圖5B)，占真菌總數的93.46%～97.64%，其中，轉TaLEA、轉betA和轉WRKY70小黑楊根際擔子菌門相對豐度顯著高于WT株系。

小黑楊根際土壤樣品細菌群落結構在屬水平上的組成和豐度如圖6A所示。參試樣品土壤細菌群落前20占細菌總量的33.13%～38.74%，由圖6可知參試樣品在組成上比較接近，同時在幾個屬的豐度上存在差異。與WT小黑楊比較，在3種轉基因小黑楊根際土壤中假雙頭斧形菌屬(Pseudolabrys)、產黃桿菌屬(Rhodanobacter)及德沃斯氏菌屬(Devosia)豐度均有不同程度的提高，而鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)豐度則呈現不同程度的降低；在轉betA小黑楊和轉WRKY70小黑楊中，芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和Ramlibacter豐度有不同程度的提高；Occallatibacter僅在轉TaLEA小黑楊中豐度更高；同時Ellin6067豐度僅在betA小黑楊中升高。

根際土壤真菌群落結構在屬水平上排名前20的物種相對豐度分析顯示(圖6B)，參試樣品真菌群落前20占真菌總量的82.21%～93.75%，不同小黑楊之間的真菌群落多樣性和豐度存在差異。與WT小黑楊比較，3種轉基因小黑楊根際土壤中Serendipita豐度均升高，亞隔孢殼屬(Didymella)和背芽突霉屬(Cadophora)豐度則降低了85%以上；轉TaLEA小黑楊、轉WRKY70小黑楊的棉革菌屬(Tomentella)豐度降低，粘滑菇屬(Hebeloma)則高于WT小黑楊；另外，轉TaLEA及betA小黑楊根際土壤中的絲蓋傘屬(Inocybe)豐度有不同程度的提高，小球孢盤菌屬(Sphaerosporella)和蠟蘑屬(Laccaria)僅在TaLEA根際土壤中豐度較高。

3 討 論

植物生長的土壤中存在大量微生物，主要包括細菌、真菌、放線菌和土壤原生動物。其中細菌及真菌對土壤生態系統的作用至關重要[30]。研究發現，根際土壤細菌及真菌群落組成非常敏感，受植物種類、植株生長時期、耕種管理方式及外源基因的導入等生物和非生物因素的影響[31]。為了解轉TaLEA、轉betA及轉WRKY70小黑楊對土壤微生物群落組成產生的影響，本研究采用高通量測序技術分別對轉TaLEA、轉betA及轉WRKY70小黑楊與野生型小黑楊的根際土壤細菌及真菌群落差異進行分析。結果發現，轉betA及WRKY70小黑楊影響了根際土壤細菌及真菌群落多樣性、群落豐度，低于或顯著低于WT小黑楊，轉TaLEA小黑楊在真菌群落豐富度和多樣性方面顯著低于WT小黑楊，表明外源基因的導入或過量表達對根際微生物群落產生一定影響。根據參試樣品的韋恩圖、主成分分析和聚類熱圖顯示，轉TaLEA小黑楊與WT小黑楊的群落組成非常相似，轉betA小黑楊與轉WRKY70小黑楊群落組成更接近，說明轉betA及轉WRKY70小黑楊的根際土壤細菌和真菌群落結構與WT小黑楊明顯不同。前人研究發現，轉基因植物可能對土壤微生物群落產生影響，但該影響遠遠小于作物的生育及生長季節、田間管理、肥料的施加等因素對土壤微生物產生的影響[32-33]。同樣，Gyamfi等[34]對轉抗除草劑基因油菜(Brassicanapus)的研究也證明，轉基因油菜根際微生物群落較野生型發生了輕微變化，認為這種影響只是暫時的，與油菜發育階段引起的微生物群落變化相比要小。對轉cry1Ac基因和轉cry1Ab基因水稻安全性分析顯示，在生長發育的旺盛期轉基因水稻對土壤細菌數量、多樣性及功能多樣性產生一定的影響，但這種影響并不持續，隨著轉基因水稻的生長發育直至成熟期而逐漸消失[35]。本實驗的季節正是處于楊樹生長最旺盛的季節，轉betA、轉WRKY70小黑楊的根際土壤細菌和真菌群落結構與WT小黑楊的差異能否隨著生長發育而減弱，還需后續實驗驗證。

參試轉基因小黑楊根際土壤細菌群落結構在屬水平上的組成和豐度分析顯示，與WT小黑楊比較，在3種轉基因小黑楊根際土壤中假雙頭斧形菌屬、產黃桿菌屬及德沃斯氏菌屬豐度均有不同程度的提高；Ellin6067豐度在轉betA小黑楊土壤中明顯升高，較其余樣品均值高20.44%，而在轉TaLEA小黑楊土壤中則較其余小黑楊樣品的均值低19.83%；對于Occallatibacter豐度則僅在轉TaLEA小黑楊土壤中顯著提高，較其余樣品均值提升31.52%。

研究已證明假雙頭斧形菌屬是植物根際的有益細菌，能夠促進植物對激素、生物堿以及氮的代謝等，進而促進植物的生長發育，提高植物抵抗病原菌的能力，可具有抑制土壤病原菌并促進植物生長、提升土壤酶活性及分解土壤中有害物質的作用，被稱為“烴類降解劑”[36-38]。產黃桿菌屬有能夠降解氯化芳香族化合物及各種芳香族化合物的功能[39-40]，Ellin6067為氨氧化細菌，參與分解利用土壤中幾丁質的Occallatibacter、能夠分解有機質提升土壤肥力的芽單胞菌屬等土壤有益菌的生長情況也在不同轉基因小黑楊中得到提升[41-43]。

真菌群落結構在屬水平上的組成分析顯示，致病真菌背芽突霉屬(Cadophora)和亞隔孢殼屬(Didymella)[44-45]在3種轉基因小黑楊中均被明顯抑制，同時一些有益的菌根真菌豐度明顯高于WT小黑楊。這其中絲蓋傘屬豐度在轉TaLEA、betA小黑楊中顯著高于另外兩個樣品，分別為13.97%和15.44%；小球孢盤菌屬、粘滑菇屬、蠟蘑屬豐度僅在轉TaLEA小黑楊中顯著提高，其豐度分別較其余樣品均值提升了6倍、18倍和1倍。這些菌根真菌屬的某些種已經被鑒定為楊樹外生菌根真菌主要類群[46-50]。

本實驗中所涉及的betA、TaLEA外源基因是兩個廣泛應用于植物基因工程的功能基因，其表達產物分別為甘氨酸甜菜堿及晚期胚胎富集蛋白，導入小黑楊基因組后能夠不同程度的提高受體的耐鹽性[8-9]，WRKY70屬于WRKY轉錄因子超家族第Ⅲ類亞家族成員，在植物的生物及非生物脅迫調控網絡中起著關鍵作用，轉WRKY70-RNAi小黑楊耐鹽性明顯提高[11]。上述轉基因小黑楊在生長發育過程中可能通過根系分泌物或其他途徑富集根際土壤中潛在益生菌及菌根真菌，這些細菌與真菌可能參與抑制有害微生物的生長，提高了轉基因植株抗逆能力，進而增強了轉基因小黑楊的抗非生物脅迫能力，這種推測還需后續試驗進行證明。

實驗雖然發現轉TaLEA、轉betA及轉WRKY70小黑楊對根際土壤細菌及真菌多樣性及豐度產生了一些影響，但這些影響主要表現為轉基因小黑楊根際潛在益生菌的增加、致病菌的減少。筆者認為僅這一方面的變化并不足以評判其對環境而言安全與否，還需深入分析根際微生物群落結構是否合理、微生物間的是否具有拮抗作用，以及這種影響是否是因為本研究轉基因楊樹正處于生長季，或這些影響是否只是暫時性等。因此，后續還需對3種轉基因小黑楊在不同發育時期及不同年份進行根際土壤微生物群落結構研究，進一步評價其對環境微生物群落組成的影響。