LINC00657對結直腸癌細胞惡性行為影響及機制

張生軍 趙阿靜 張安瑞 李雅微 李小寶 劉敏麗

［摘要］ 目的

探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）LINC00657通過調控miR-26b及其靶基因黏膜相關組織淋巴瘤異位基因1（MALT1）對結直腸癌（CRC）細胞增殖、侵襲和遷移的影響。

方法 用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測正常腸上皮細胞（NCM460）、CRC細胞系（HT29、HCT116和SW620）中LINC00657的表達水平。對HT29細胞轉染shRNA-LINC00657或shRNA-CON，分析沉默LINC00657對癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響。用雙熒光素酶報告基因驗證LINC00657、miR-26b和MALT1的靶向作用關系。對HT29細胞分別僅轉染shRNA-LINC00657、同時轉染shRNA-LINC00657+miR-26b inhibitor、同時轉染shRNA-LINC00657+pcDNA-MALT1，分析LINC00657通過miR-26b/MALT1軸對細胞增殖、侵襲和遷移的影響。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，通過Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力。應用RT-PCR檢測MALT1 mRNA表達水平，Western blot檢測MALT1蛋白的表達水平。

結果 CRC細胞系（HT29、HCT116和SW620）的LINC00657表達水平均高于正常腸上皮細胞（NCM460），差異有統計學意義（F=30.267，P<0.05）。沉默LINC00657可以抑制HT29細胞的增殖、侵襲和遷移（t=9.123～18.456，P<0.05）。雙熒光素酶報告基因檢測證實，LINC00657靶向作用于miR-26b并下調其表達，miR-26b可負調控MALT1的表達。沉默LINC00657表達可抑制HT29細胞中MALT1 mRNA和蛋白的表達水平（F=15.893、17.231，P<0.05）。轉染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或shRNA-LINC00657+MALT1過表達載體以后，MALT1 mRNA和蛋白的表達水平較僅轉染shRNA-LINC00657明顯上調（F=15.893、17.231，P<0.05），細胞增殖、侵襲和遷移能力也升高（F=4.783～8.893，P<0.05）。

結論 LINC00657在CRC細胞中高表達，可通過調控miR-26b/MALT1軸促進癌細胞增殖、侵襲以及遷移。

［關鍵詞］ 結直腸腫瘤；RNA，長鏈非編碼；黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤易位1蛋白；細胞增殖；腫瘤浸潤

［中圖分類號］ R735.34;R342.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0860-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.203

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240104.1606.004;2024-01-05 20：10：18

EFFECTS OF LINC00657 ON MALIGNANT BEHAVIOR OF COLORECTAL CANCER CELLS AND UNDERLYING MECHANISMS

ZHANG Shengjun， ZHAO Ajing， ZHANG Anrui， LI Yawei， LI Xiaobao， LIU Minli

（Department of General Surgury， The Affiliated Hospital of Yan′an University， Yan ′an 716000， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of long non-coding RNA （LINC00657） on the proliferation， invasion， and migration of colorectal cancer （CRC） cells by regulating miR-26b and its target gene mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1 （MALT1）.

MethodsReverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to mea-

sure the expression of LINC00657 in normal intestinal epithelial cells （NCM460） and CRC cell lines （HT29， HCT116， and SW620）. HT29 cells were transfected with shRNA-LIC00657 or shRNA-CON to analyze the effects of silencing LINC00657 on the proliferation， invasion， and migration of cancer cells. The targeted relationship between LINC00657， miR-26b， and MALT1 was verified by dual-luciferase reporter assay. HT29 cells were separately transfected with shRNA-LINC00657 alone， shRNA-

LINC00657+miR-26b inhibitor， and shRNA-LINC00657+pcDNA-MALT1 to analyze the effects of LINC00657 on cell proliferation， invasion， and migration through the miR-26b/MALT1 axis. Cell proliferation was determined using Cell Counting Kit-8. Cell invasion and migration was determined using Transwell assay. The expression level of MALT1 mRNA was measured by RT-PCR. The expression level of MALT1 protein was measured by Western blot.

ResultsThe expression levels of LINC00657 in CRC cell lines （HT29， HCT116， and SW620） were significantly higher than that in normal intestinal epithelial cells （NCM460） （F=30.267，P<0.05）. Silencing LINC00657 significantly inhibited the proliferation， invasion， and migration of HT29 cells （t=9.123-18.456，P<0.05）. The dual-luciferase reporter assay showed that LINC00657 targeted miR-26b to downregulate its expression， and miR-26b negatively regulated the expression of MALT1. Silencing LINC00657 expression significantly inhibited the expression of MALT1 mRNA and protein in HT29 cells （F=15.893，17.231，P<0.05）. Compared with those transfected with

shRNA-LINC00657 alone， the cells transfected with shRNA-

LINC00657+miR-26b inhibitor or shRNA-LINC00657+MALT1 overexpression vector had significantly up-regulated expression of MALT1 mRNA and protein （F=15.893，17.231，P<0.05） and significantly increased abilities of cell proliferation， invasion， and migration （F=4.783-8.893，P<0.05）.

ConclusionLINC00657 is highly expressed in CRC cells， which can promote the proliferation， invasion， and migration of cancer cells by regulating the miR-26b/MALT1 axis.

［KEY WORDS］colorectal neoplasms; RNA， long noncoding; mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation 1 protein; cell proliferation; neoplasm invasiveness

結直腸癌（CRC）是消化道常見惡性腫瘤之一，其發病率和病死率呈逐年上升之勢［1］。我國CRC新發人數占所有新發惡性腫瘤的9.9%［2］。CRC發病機制尚未完全闡明，因此，進一步探索CRC的發病機制，對尋找其治療靶點有重要意義。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度超過200個核苷酸的RNA，在表觀遺傳調控等方面起到重要作用，在人體各個組織中均有表達［3］。研究發現，lncRNA與細胞增殖、分化、細胞周期、凋亡和自噬等密切相關，參與腫瘤發生發展［3］。lncRNA有望成為CRC在內的多種惡性腫瘤的生物標志物。 LINC00657是近年來發現的一種lncRNA，在CRC細胞系和組織中高表達，過表達LINC00657可促進CRC細胞增殖和侵襲［4］。血清LINC00657高表達與CRC病人不良生存預后有關［5］。lncRNA可作為一種競爭性內源性RNA與微小RNA（microRNA，簡稱miRNA）相互作用，進而調控信使RNA（mRNA）的表達。微小RNA-26b（miR-26b）在多種癌癥中發揮抑癌基因作用［6-7］，過表達miR-26b可以抑制CRC細胞的增殖和侵襲［8］。黏膜相關組織淋巴瘤異位基因1（MALT1）是miR-26b下游基因，miR-26b可負調控MALT1的表達進而抑制腫瘤進展［9］。本文分析LINC00657靶向調控miR-26b/MALT1對CRC細胞增殖、侵襲以及遷移的影響，為LINC00657在CRC中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

正常腸上皮細胞（NCM460）以及CRC細胞系（HT29、HCT116和SW620）購于中國科學院上海細胞庫。將細胞培養于含胎牛血清的改良Eagle培養液（DMEM）中，并加入10 g/L青霉素-鏈霉素，培養條件為37 ℃、體積分數0.05的CO2。細胞融合度達80%～90%時進行傳代。

shRNA-LINC00657、miR-26b inhibitor、miR-26b mimics、攜帶有MALT1基因的過表達重組載體pcDNA-MALT1均購于上海吉瑪制藥技術有限公司。胎牛血清、DMEM培養基、CCK-8試劑盒、Transwell小室均購于上海炎怡生物科技有限公司。Lipofect AMINETM 2000試劑盒、反轉錄試劑盒和PCR試劑盒、凝膠快速制備試劑盒均購于日本寶生物工程株式會社。兔抗人MALT1多克隆抗體、GAPDH抗體均購于美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同細胞LINC00657相對表達量檢測 采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測正常腸上皮細胞（NCM460，a組）、CRC細胞系（HT29，b組；HCT116，c組；SW620，d組）的LINC00657表達水平。用TRIzol法提取細胞RNA，隨后反轉錄得到cDNA，反應條件為37 ℃、15 min，85 ℃、15 s。以cDNA為模板，PCR反應條件為：95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，60 ℃、15 s，72 ℃，20 s。LINC00657引物及其序列見表1。用2－△△Ct法計算LINC00657相對表達量。

1.2.2 沉默LINC00657對HT29細胞增殖、侵襲和遷移的影響 將細胞分為shRNA-CON組（轉染shRNA-CON，a組）和shRNA-LINC00657組（轉染shRNA-LINC00657，b組），并嚴格按照Lipofect AMINETM 2000試劑盒步驟進行細胞轉染。采用1.2.1的RT-PCR方法檢測兩組細胞的LINC00657表達水平。采用CCK-8檢測細胞增殖：嚴格按照CCK-8試劑盒說明進行操作，取對數生長期細胞，以每孔1×104個細胞密度接種于96孔板；待細胞貼壁后，分別于培養24、48、72、96 h時加入10 μL的CCK-8溶

液；用酶標儀檢測光密度（OD）值，反映細胞增殖能力；實驗重復4次。采用Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移：嚴格按照Transwell試劑盒的說明書進行操作。遷移實驗：將細胞密度調整為1.5×108/L，取200 μL細胞懸液加入Transwell上室；向下室中加入600 μL培養液，培養2 h后棄去培養液，用棉簽擦去上室中未遷移細胞，加入甲醇固定10 min；隨后用1 g/L結晶紫染色15 min，顯微鏡下（放大40倍）觀察細胞形態并計數細胞。

侵襲實驗：用細胞培養液將基質膠（Matrigel）稀釋15倍，隨后加入Transwell上室，37 ℃培養4 h；后續步驟同遷移實驗。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因實驗驗證LINC00657、miR-26b和MALT1的作用關系 用StarBase工具預測LINC00657和miR-26b的結合位點，預測miR-26b和MALT1的結合位點。根據預測結果，設計并且合成結合位點的野生型（WT）和突變型（MT）序列。①分別將結合位點的野生型序列（MT-LINC00657）及突變型序列（WT-LINC00657）插入熒光素酶報告基因載體（Pgl3-basic），分別與過表達靶基因質粒（miR-26b mimics）或陰性對照共轉染HEK239細胞，分別檢測陰性對照組（a組）與LINC00657沉默組（shRNA-LINC00657組，b組）miR-26b表達水平。②分別將結合位點的野生型序列（MT-miR-26b）及突變型序列（WT-miR-26b）插入熒光素酶報告基因載體（Pgl3-basic），分別與過表達靶基因質粒（pcDNA-MALT1）或陰性對照共轉染HEK239細胞，分別檢測陰性對照組與miR-26b抑制組（miR-26b inhibitor組，c組）MALT1表達水平。最后檢測熒光素酶相對活性。

1.2.4 上調miR-26b/MALT1對HT29細胞增殖、侵襲和遷移的影響 ①轉染和分組：細胞轉染步驟嚴格按照Lipofect AMINETM 2000試劑盒進行，將細胞隨機分為CON組（不轉染，a組）、shRNA-LINC00657組（僅轉染shRNA-LINC00657，b組）、shRNA-LINC00657+miR-26b inhibitor組（轉染shRNA-LINC00657和miR-26b inhibitor，c組）、shRNA-LINC00657+MALT1組（細胞同時轉染shRNA-LINC00657和過表達載體pcDNA-MALT1，d組）。②RT-PCR檢測MALT1 mRNA表達水平：引物及其序列見表2。③Western blot檢測MALT1蛋白表達水平：細胞中加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，在冰上裂解30 min后離心10 min，應用BCA試劑盒進行蛋白定量。隨后加入上樣緩沖液，并煮沸5 min，應用SDS-PAGE分離蛋白并將其轉移至PVDF膜上，應用50 g/L的脫脂牛奶封閉1 h。加入MALT1抗體（1∶500）以及GAPDH抗體（1∶1 000），孵育過夜。洗膜3次后，加入羊抗兔IgG抗體（1∶5 000，美國Sigma公司），孵育1 h后洗膜3次，最后進行ECL顯色。④采用CCK-8檢測細胞增殖，采用Transwell 實驗檢測細胞侵襲和遷移。

1.3 統計學分析

應用SPSS 20.0統計軟件處理數據。計量資料以±s形式表示，兩組間均數比較用t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗；重復測量數據采用重復測量方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結? 果

2.1 CRC細胞系LINC00657表達水平

CRC細胞系（包括HT29、HCT116和SW620）LINC00657表達水平的總體比較，差異有統計學意義（F=30.267，P<0.001）。LSD兩兩比較結果顯示，HT29、HCT116和SW620的LINC00657表達水平均高于正常腸上皮細胞（NCM460），差異有統計學意義（P均<0.05）。見圖1。

統計學意義（t=9.123～18.456，P<0.05）。重復測量方差分析顯示，隨著時間延長兩組細胞增殖活力均升高（F時間=10.002，P<0.05），組間總體差異有顯著性（F組間=6.897，P<0.05），時間和組間交互作用同樣顯著（F時間×組間=4.001，P<0.05），LSD兩兩比較發現細胞培養48、72、96 h時shRNA-CON組細胞增殖活力均高于shRNA-LINC00657組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 LINC00657靶向調控miR-26b介導MALT1的表達

用StarBase工具預測LINC00657和miR-26b的結合位點。見圖3A。將WT-LINC00657插入熒光素酶報告基因載體，過表達miR-26b后熒光素酶的活性下降（t=5.674，P<0.05）。見圖3B。沉默LINC00657后，miR-26b表達水平升高（t=8.123，P<0.05）。見圖3C。以上結果提示，miR-26b是LINC00657的靶基因。用StarBase工具預測miR-26b和MALT1的結合位點見圖3D。將WT-miR-26b插入熒光素酶報告基因載體，過表達miR-26b后熒光素酶活性下降（t=7.009，P<0.05）。見圖3E。抑制miR-26b后，MALT1表達水平升高（t=11.120，P<0.05）。見圖3F。提示MALT1是miR-26b的靶基因。

2.4 上調miR-26b/MALT1對HT29細胞增殖、侵襲、遷移的影響shRNA-LINC00657組、shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor組、shRNA-LINC00657+MALT1組及CON組的MALT1蛋白及基因表達水平、細胞侵襲、細胞遷移的總體比較，差異有統計學意義（F=7.230～17.231，P<0.05）。兩兩比較顯示，與CON組相比，沉默LINC00657表達可以抑制HT29細胞中MALT1 mRNA和蛋白表達水平，差異有顯著性（P均<0.05）。轉染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或者shRNA-LINC00657+MALT1過表達載體后，MALT1 mRNA和蛋白的表達水平較shRNA-LINC00657組明顯上調（P<0.05）。見圖4A、B。

重復測量方差分析顯示，隨著時間延長4組細胞增殖活力均升高（F時間=29.897，P<0.05），組間總體比差異有顯著性（F組別=4.783，P<0.05），時間和組別的交互作用同樣有顯著性（F時間×組別=3.897，P<0.05）。兩兩比較結果顯示，與CON組相比較，細胞培養48、72、96 h時沉默LINC00657可明顯抑制HT29細胞的增殖（P<0.05）。轉染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或shRNA-LINC00657+MALT1過表達載體后，HT29細胞的增殖力較shRNA-LINC00657組高（P<0.05）。見圖4C。

與CON組相比較，沉默LINC00657可以顯著抑制HT29細胞的侵襲和遷移（P均<0.05）。轉染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或者shRNA-LINC00657+MALT1過表達載體后，HT29

細胞的侵襲和遷移力較shRNA-LINC00657組高（P均<0.05）。見圖5。

3 討? 論

lncRNA作為競爭性內源性RNA與miRNA相互作用，進而調控mRNA表達，在CRC發生發展中發揮重要作用［10］。有研究發現，LINC00657高表達與乳癌［11］和胰腺癌［12］等發生發展有關。本文研究結果顯示，CRC細胞系中LINC00657表達水平升高，與既往報道一致［4，13］。另外，沉默LINC00657可以抑制HT29細胞的增殖、侵襲以及遷移，這提示LINC00657參與CRC發生。

LINC00657在腫瘤中的作用機制目前尚未完全明確。已有研究顯示，LINC00657高表達可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，并抑制凋亡［11，14］。在CRC中，LINC00657高表達可通過促進肝素酶（HPSE）基因轉錄，促進CRC細胞侵襲和遷移［4］。另外，LINC00657高表達也能通過激活PI3K/AKT通路促進直腸癌細胞的增殖和侵襲［13］。

LINC00657可通過miRNA/mRNA軸促進腫瘤進展，例如，LINC00657高表達通過miR-26b-5p/COMMD8軸促進非小細胞肺癌進展［14］；通過miR-424/PD-L1軸促進肝細胞癌進展［15］。本研究通過生物信息學分析表明，LINC00657和miR-26b有結合位點，miR-26b和MALT1有結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗證實了miR-26b是LINC00657的靶基因，MALT1是miR-26b的靶基因。已有研究表明，miR-26b參與CRC進展［16］，并且MALT1也是CRC的治療靶點［17］。為了進一步證實沉默

LINC00657通過上調miR-26b/MALT1對HT29細胞增殖、侵襲、遷移的影響，本文研究對HT29細胞進行轉染，結果顯示，轉染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或者轉染shRNA-LINC00657+MALT1過表達載體后，細胞增殖、侵襲和遷移能力較僅轉染shRNA-LINC00657的細胞高。以上結果提示，LINC00657通過上調miR-26b/MALT1調控CRC細胞行為。

綜上所述，LINC00657在CRC細胞中高表達，可通過調控miR-26b/MALT1軸促進癌細胞增殖、侵襲和遷移。LINC00657可能成為CRC治療靶點。本研究也存在一些局限性，例如未檢測CRC組織LINC00657的表達水平及其與病人生存預后的關系。未來需要開展臨床和基礎研究，進一步探尋LINC00657在CRC中的作用機制。

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（本文編輯 牛兆山）