巖藻多糖對高尿酸誘導HepG2細胞凋亡影響及機制

裴忠仟 薛美蘭 楊佳 張楠 高海琪

［摘要］ 目的

探討巖藻多糖（Fucoidan）對高濃度尿酸（UA）誘導的人肝癌細胞（HepG2）線粒體凋亡的影響及機制。

方法 HepG2細胞隨機分為對照組（加無藥物培養液）、UA模型組（加入0.2 g/L UA溶液）、白黎蘆醇組（Res組，用1 μmol/L白藜蘆醇溶液預處理24 h后加入0.2 g/L UA溶液）、 F1組（加入0.2 g/L UA+20 mg/L Fucoidan溶液處理）、F2組（加入0.2 g/L UA +40 mg/L Fucoidan溶液處理）、F1+EX527組（加入0.2 g/L UA +20 mg/L Fucoidan+1 μmol/L EX527溶液處理）、F2+EX527組（加入0.2 g/L UA +40 mg/L Fucoidan +1 μmol/L EX527溶液處理）。各組加入相應藥物處理24 h后，應用CCK8實驗檢測HepG2細胞活力，ELISA實驗檢測細胞上清液丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平及細胞內超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平；熒光顯微鏡檢測活性氧（ROS）和線粒體膜電位，流式細胞儀測定細胞凋亡率，Western blot方法檢測Sirt1蛋白表達。

結果 與對照組相比，UA模型組HepG2細胞活力降低（F=295.200，P<0.01），細胞上清液ALT和AST水平升高（F=204.300、9.511，P<0.01），細胞內SOD和GSH水平降低（F=47.880、8.261，P<0.01），

MDA含量增加（F=132.400，P<0.01），ROS生成增加（F=23.720，P<0.05），Sirt1蛋白表達下調（F=64.520，P<0.01），細胞凋亡率明顯升高（F=19.200，P<0.01）；與UA模型組相比，Res組、F1組和F2組HepG2細胞生存率增加，ALT和AST水平降低，細胞內SOD和GSH水平增加，MDA含量降低，差異均有顯著性（P<0.01）；與UA模型組相比，F2組細胞內ROS生成減少，線粒體膜電位下降，Sirt1蛋白表達上調，細胞凋亡率下降，差異有顯著性（P<0.05）。加入Sirt1抑制劑EX527能顯著逆轉Fucoidan的抗氧化和抗凋亡作用，差異有顯著性（P<0.05）。

結論 Fucoidan通過上調Sirt1蛋白表達抑制線粒體氧化應激，逆轉UA誘導的HepG2細胞線粒體凋亡。

［關鍵詞］ 尿酸；巖藻多糖；癌，肝細胞；氧化性應激；細胞凋亡

［中圖分類號］ R343.23

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0867-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.200

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240104.1739.011;2024-01-08 08：59：14

EFFECT OF FUCOIDAN ON HEPG2 CELL APOPTOSIS INDUCED BY HIGH URIC ACID AND ITS MECHANISM

PEI Zhongqian， XUE Meilan， YANG Jia， ZHANG Nan， GAO Haiqi

（Basic Medical College， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of fucoidan on mitochondrial apoptosis in human hepatoma （HepG2） cells induced by high concentration of uric acid （UA） and its mechanism.

MethodsHepG2 cells were randomly divided into control group （added with drug-free culture solution）， UA model group （added with 0.2 g/L UA solution）， resveratrol group （Res group， pretreated with 1 μmol/L resveratrol solution for 24 h， and then added with 0.2 g/L UA solution）， F1 group （added with 0.2 g/L UA + 20 mg/L fucoidan）， F2 group （added with 0.2 g/L UA + 40 mg/L fucoidan）， F1+EX527 group （added with 0.2 g/L UA + 20 mg/L fucoidan + 1 μmol/L EX52）， and F2+EX527 group （added with 0.2 g/L UA + 40 mg/L fucoidan + 1 μmol/L EX527）. After 24 h treatment with corresponding drugs， Cell Counting Kit-8 assay was used to determine the viability of HepG2 cells; enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） levels in the cell supernatant， as well as intracellular superoxide dismutase （SOD）， reduced glutathione （GSH）， and malondialdehyde （MDA） levels; fluorescence microscopy was used to measure reactive oxygen species （ROS） production; flow cytometry was used to determine the cell apoptosis rate， and Western blot was used to measure the expression of Sirt1.

Results

Compared with the control group， the UA model group had significantly lower HepG2 cell viability （F=295.200，P<0.01）， SOD and GSH levels （F=47.880，8.261;P<0.01）， and Sirt1 protein expression （F=64.520，P<0.01）， and significantly higher ALT and AST levels in cell supernatant （F=204.300，9.511;P<0.01）， MDA content （F=132.400，P<0.01）， ROS production （F=23.720，P<0.05）， and cell apoptosis rate （F=19.200，P<0.01）. Compared with the UA model group， the Res group， F1 group， and F2 group had significantly higher HepG2 cell survival rates and SOD

and GSH levels （all P<0.01）， and significantly lower ALT and AST levels and MDA content （all P<0.01）. Compared with the UA model group， the F2 group had significantly higher Sirt1 expression， and significantly lower intracellular ROS production， mitochondrial membrane potential， and cell apoptosis rate （P<0.05）. The addition of Sirt1 inhibitor EX527 significantly reversed the antioxidant and anti-apoptotic effects of fucoidan （P<0.05）.

ConclusionFucoidan can inhibit mitochondrial oxidative stress and reverse UA-induced mitochondrial apoptosis in HepG2 cells by up-regulating Sirt1 expression.

［KEY WORDS］uric acid; fucoidan; carcinoma， hepatocellular; oxidative stress; apoptosis

尿酸（UA）是人體嘌呤代謝的終產物，UA增加使機體多種器官組織處于氧化應激狀態，可能引起內皮功能障礙、炎癥和血管收縮等，是心血管疾病、代謝綜合征和肝腎疾病發展的獨立危險因素［1-5］。暴露于高水平UA的肝細胞更容易出現線粒體功能障礙、脂質沉積及纖維化［6-7］。高尿酸血癥大鼠肝臟的丙二醛（MDA）水平升高，活性氧（ROS）水平降低，提示高尿酸血癥可誘導氧化應激導致肝細胞抗氧化水平下降。既往研究顯示，只有不到40%的病人可以通過服用別嘌呤醇（高尿酸血癥一線治療藥物）將其血清UA水平降至正常水平，且可能導致過敏反應、肝腎損傷以及微量元素丟失［8］。因此，篩選出安全有效的天然藥物用于預防或治療高尿酸血癥具有重要意義。

巖藻多糖（Fucoidan）是從褐藻中提取的含有L-巖藻糖的天然活性物質。有研究顯示，高尿酸血癥大鼠服用Fucoidan（150 mg/kg）可抑制肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性并增加腎臟UA排泄［9］。Fucoidan作為天然抗氧化劑可以恢復細胞過氧化氫酶（CAT）、SOD和谷胱甘肽過氧化酶（GPx）活性，顯著降低脂質過氧化和一氧化氮水平［10］。Sirt1是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶（NAD+）的去乙?；?，具有抗氧化作用［11］。已有研究發現，Fucoidan通過上調肝細胞Sirt1分子表達，參與調節肝臟中的葡萄糖和脂質代謝［12-14］。由此推測，Fucoidan可能通過調節Sirt1表達、抑制肝細胞線粒體氧化應激來逆轉高濃度UA誘導的肝細胞凋亡。本研究探討Fucoidan對高濃度UA誘導的人肝癌細胞（HepG2）線粒體凋亡的影響及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

Fucoidan購自美國Sigma公司；白藜蘆醇以及Sirt1抑制劑EX527 （Selisistat） 購自美國GlpBio公司；CCK8工作液購自碧云天生物公司；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；還原型谷胱甘肽（GSH）、MDA和ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司； ROS檢測試劑盒購自Biosharp公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1法）購自上海翊圣生物科技有限公司；抗β-actin和Sirt1兔一抗購自博士德生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞分組及藥物干預 HepG2細胞接種于96孔板中，分別給予0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 g/L UA溶液干預24 h，CCK8實驗檢測細胞活力，篩選出用于建立高UA氧化應激細胞模型的最適UA濃度。然后將HepG2細胞分為對照組（Control組）、UA組、UA聯合不同濃度（5、10、20、40、60、80 mg/L）Fucoidan干預組，Fucoidan組分別加入相應濃度Fucoidan培養24 h，CCK8實驗檢測細胞活力，篩選出合適的Fucoidan干預劑量。后續實驗將HepG2細胞分為對照組（Control組）、UA模型組、白藜蘆醇組（Res組）、F1組、F2組、F1+EX527組和F2+EX527組。Control組加入無藥物培養液；UA模型組加入0.2 g/L UA溶液；Res組用1 μmol/L白藜蘆醇溶液預處理24 h，棄掉培養液，加入0.2 g/L UA溶液；

F1組加入0.2 g/L UA+

20 mg/L Fucoidan溶液；F2組加入0.2 g/L UA +40 mg/L Fucoidan溶液；F1+EX527組加入0.2 g/L UA +20 mg/L Fucoidan+1 μmol/L EX527溶液處理；F2+EX527組加入0.2 g/L UA +40 mg/L Fucoidan +1 μmol/L EX527溶液，各組培養液體積相同。

1.2.2 CCK8方法檢測細胞活力 每組設置5個復孔，加相應藥物處理24 h，棄去孔內培養液，加入200 μL CCK8工作液孵育4 h。使用酶標儀檢測450 nm波長處各孔光密度（OD）值，計算細胞活力。細胞活力（%）=（OD測量值－OD空白值）/（OD對照值－OD空白值）×100%。

1.2.3 酶聯免疫吸附測定（ELISA）實驗檢測細胞及上清液抗氧化指標 每組設置3個復孔，相應藥物干預24 h后分別收集細胞上清液及貼壁細胞。應用ALT、AST試劑盒檢測細胞、上清液ALT和AST水平；貼壁細胞經超聲破碎后取上清，按照試劑盒說明書步驟檢測細胞內SOD、GSH、MDA水平。

1.2.4 熒光顯微鏡檢測HepG2細胞內ROS和線粒體膜電位變化 分別應用ROS檢測試劑盒和JC-1試劑盒檢測HepG2細胞內ROS含量和線粒體膜電位。細胞接種于6孔板內，按照分組進行相應藥物干預，24 h后棄去培養液。分別加入無血清培養液稀釋H2DCFH-DA和JC-1染色工作液，孵育30 min后洗滌細胞，熒光顯微鏡下觀察細胞內ROS熒光和線粒體膜電位JC-1熒光信號變化。應用Image J軟件分析熒光強度。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 各組細胞分別給予相應藥物干預24 h后，胰酶消化，PBS洗滌后重懸細胞，調整細胞密度為1×109/L。每管加入細胞懸液100 μL及Annexin V-FITC 5 μL，避光混勻10 min，再加入5 μL PI，避光孵育5 min。最后應用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 Western blot方法檢測Sirt1蛋白表達 各組細胞分別給予相應藥物干預后收集并裂解細胞，用BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白質并轉移到PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶粉溶液封閉2 h后，將膜與一抗（β-actin、Sirt1，1∶1 000）孵育，4 ℃過夜。TBST洗滌3次，加入HRP偶聯二抗（1∶10 000），37 ℃孵育1 h。

TBST洗滌3次。配制1×ECL顯影液，最后將膜置于成像儀上顯影。

用Image J軟件進行蛋白質印跡分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計學處理。計量資料結果以±s表示，兩組數據比較采用t檢驗；多組數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結? 果

2.1 不同濃度UA對HepG2細胞活力的影響

與Control組相比，不同濃度（0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 g/L）UA處理組HepG2細胞存活率差異有顯著性（n=3，F=63.906，P<0.01），其中0.16、0.20、0.24 g/L UA處理組的HepG2細胞存活率較對照組顯著降低（t=6.208～12.550，P<0.01）。見圖1。

2.2 不同濃度Fucoidan聯合UA處理對HepG2細胞活力的影響

0.2 g/L UA和不同濃度Fucoidan聯合UA處理HepG2細胞24 h，UA模型組細胞活力較Control組明顯降低（n=6，F=28.110，t=7.188，P<0.01），不同濃度Fucoidan組細胞存活率與UA模型組相比差異有顯著性（F=15.370，P<0.01），其中20 mg/L和40 mg/L Fucoidan干預組的細胞存活率均較UA組增加（t=2.435、3.045，P<0.05），100 mg/L濃度Fucoidan處理后細胞存活率顯著降低（t=6.417，P<0.01）。見圖2。故本文選擇濃度為20 mg/L和40 mg/L的Fucoidan聯合0.2 g/L UA處理HepG2細胞24 h用于后續實驗。

2.3 Fucoidan對HepG2細胞活力的影響

與Control組相比，UA模型組細胞活力下降（n=6，F=295.200，t=28.550，P<0.01）;與UA模型組相比較，Res組、F1組和F2組細胞存活率升高，差異有顯著性（t=11.220～28.350，P<0.01）。F1+EX527組HepG2細胞存活率較F1組顯著降低（t=3.143，P<0.05），F2+EX527組細胞存活率較F2組明顯降低（t=13.520，P<0.01）。見圖3。

2.4 Fucoidan對UA誘導的HepG2細胞ALT和AST水平的影響

UA模型組上清液ALT和AST水平均顯著高于Control組（n=6，F=204.300、9.511，P<0.05）。

與UA模型組相比，Res和Fucoidan處理降低了ALT和AST水平（P<0.05）；F1組和F2組ALT和AST水平較UA組下調（t=3.507～21.260，P<0.01），而Res組AST水平與UA組相比差異無顯著性（P>0.05）；與F1組相比，F1+EX527組ALT和AST含量增加（t=5.686、4.054，P<0.05）；與F2組相比，F2+EX527組ALT和AST水平明顯增加（t=3.695、10.720，P<0.05）。見圖4。

2.5 Fucoidan對UA誘導的HepG2細胞SOD、GSH和MDA水平的影響

與Control組相比較，UA模型組HepG2細胞SOD、GSH水平均降低，MDA水平升高（n=6，F=8.261～132.400，P<0.01）。Res組、F1組和F2組SOD和GSH水平較UA組顯著升高（t=3.369～11.810，P<0.01），MDA水平顯著低于UA組（t=6.656～10.860，P<0.01）。與F1組相比較，F1+EX527組SOD、GSH水平降低，MDA水平增加，差異有顯著性（t=3.879～4.943，P<0.05）；與F2組相比，F2+EX527組SOD、GSH水平降低，MDA水平增加（t=2.960～8.174，P<0.05），Sirt1抑制劑EX527抑制了Fucoidan抗氧化作用。見表1。

與Control組相比，F=8.261～132.400，##P<0.01；與UA模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與F1組相比，$P<0.05，$$P<0.01；與F2組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.6 Fucoidan對HepG2細胞ROS的影響

熒光顯微鏡觀察顯示，UA模型組綠色熒光較

Control組明顯增強，F2組的熒光強度減弱，F2+EX527組熒光較F2組增強。統計學分析顯示，UA組相對熒光強度較Control組增強，細胞內ROS生成增加（n=3，F=23.720，t=6.756，P<0.01）。與UA組相比較，F2組UA誘導的ROS增多被抑制（t=4.534，P<0.05）。F2+EX527組相對綠色熒光強度較F2組增強，ROS生成增多（t=2.929，P<0.05）。見圖5。

2.7 Fucoidan對HepG2細胞線粒體膜電位的影響

熒光顯微鏡觀察顯示，HepG2細胞中J-聚集體呈紅色熒光，J-單體顯示綠色熒光。與Control組相比，UA誘導的HepG2細胞氧化損傷導致線粒體膜

電位下降或消失，顯示較強的綠色熒光（n=3，F=

205.600，t=18.390，P<0.01）。F2組與UA組細胞線粒體膜電位比較，差異有顯著性（t=16.600，P<0.01）。F2+EX527組線粒體膜通透性增加，膜電位較F2組下調，差異有顯著性（t=9.013，P<0.01）。見圖6。

2.8 Fucoidan對HepG2細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測顯示，與Control組相比較，0.2 g/L UA顯著誘導HepG2細胞凋亡（n=3，F=19.220，t=6.167，P<0.05），40 mg/L Fucoidan干預可逆轉細胞凋亡趨勢（t=3.645，P<0.05），F2+EX527組細胞凋亡率較F2組明顯增加（t=3.724，P<0.01）。見圖7。

2.9 Fucoidan對HepG2細胞Sirt1蛋白表達水平的影響

Western blot檢測顯示，與Control組相比較，UA模型組Sirt1蛋白表達水平顯著下降（n=3，F=64.520，t=7.212，P<0.01），而Res組和F2組Sirt1表達高于UA模型組（t=8.905、9.686，P<0.01）；與F2組相比，F2+EX527組Sirt1表達降低（t=14.300，P<0.01）。見圖8。

3 討? 論

近年來，高尿酸血癥病人數量顯著增加，并呈現出年輕化趨勢［15-16］。UA由XOD產生，它可以促進還原型輔酶Ⅱ（NAPDH）的激活和ROS的釋放，導致肝臟和腎臟等多種器官氧化應激［17-18］。Fucoidan能顯著降低高尿酸血癥小鼠肝臟UA代謝關鍵酶腺苷脫氨酶（ADA）和XOD的活性，抑制UA的生成，還可以通過改善腎臟組織的功能控制尿素氮和血肌酐的含量。目前，Fucoidan已用作高尿酸血癥所導致的腎臟相關疾病的治療藥物。本研究結果顯示，Fucoidan通過上調Sirt1分子表達來抑制線粒體氧化應激，在逆轉高UA誘導的肝細胞凋亡方面發揮了保護作用。

UA誘導線粒體ROS生成增加，使線粒體成分

破壞及功能紊亂，導致過度氧化應激［19-20］。持續的氧化應激可導致肝細胞脂質沉積和纖維化，并通過線粒體膜電位喪失激活線粒體依賴性凋亡。有研究證實，Fucoidan在藥物誘導的肝損傷和肝細胞癌中具有保護細胞完整性和抑制纖維化方面的有益作用［21-22］。CHALE-DZUL等［21］研究發現，肝損傷大鼠口服50 mg/kg流動馬尾藻Fucoidan后顯示出良好的抗纖維化效果。Fucoidan可以激活Sirt1分子抑制db/db小鼠肝臟中超氧化物產生和脂質過氧化，增加CAT和SOD活性，改善肝臟氧化應激［23］。線粒體膜電位下降是內源性凋亡的早期標志［19］。本研究結果顯示，與UA模型組相比，Fucoidan處理組HepG2細胞線粒體膜電位恢復，細胞ROS生成減少，細胞上清液ALT和AST水平降低，細胞內SOD和GSH水平增加，MDA含量降低，細胞凋亡明顯減少，提示Fucoidan可以抑制線粒體氧化應激和保護線粒體功能，緩解由高UA引起的肝功能損害。

Sirt1通過組蛋白、非組蛋白和轉錄因子的脫乙酰作用參與了多種與高尿酸血癥肝臟損傷進展相關的生物學過程，如細胞氧化應激和凋亡等。體外實驗發現，UA刺激能顯著降低Sirt1 mRNA和蛋白質表達［24］，Sirt1活化劑可能通過PGC-1a/PPARg-ABCG2途徑預防高尿酸血癥［25］。Sirt1激動劑白藜蘆醇可抑制氧化應激并預防高UA誘發的急性痛風性關節炎［26-27］。因此，維持肝細胞Sirt1水平并激活Sirt1調節的抗氧化反應，可能是改善高尿酸血癥肝細胞氧化應激的一個重要途徑。相關研究發現，Fucoidan通過Sirt1依賴性方式防止β細胞損傷以及抑制糖尿病誘發的腎纖維化［28］。本文研究結果顯示，UA誘導的HepG2細胞損傷模型中Sirt1表達顯著降低，40 mg/L Fucoidan處理可上調Sirt1的表達，差異有顯著性，這可能與Fucoidan通過脫乙?；せ頕oxO3a，上調MnSOD基因表達，并抑制線粒體ROS生成和氧化應激損傷有關。本文結果顯示，用Sirt1阻滯劑EX527阻斷Sirt1活性會抑制Fucoidan誘導的抗氧化酶SOD和GSH的升高，下調ROS生成，表明Fucoidan至少部分通過激活Sirt1調控的分子通路發揮抗氧化作用。

綜上所述，Fucoidan通過上調Sirt1表達減輕高UA誘導的HepG2細胞線粒體氧化損傷，減少細胞凋亡，可作為預防或治療高尿酸血癥肝損傷的潛在藥物。相關臨床試驗結果表明，Fucoidan對人體無明顯副作用，口服給藥可以增強體內抗氧化反應［29］。Fucoidan的硫酸化、相對分子質量及提取來源是影響其抗氧化活性重要因素，未來還應進一步對其量效關系及作用機制進行研究，

以期為預防及治療高尿酸血癥所致的肝臟氧化損傷提供有效方法。

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（本文編輯 黃建鄉）