環保脫蠟液用于壞死性肉芽腫性炎抗酸染色的效果

李婷 王羚 胡佳莉 楊洋 汪亮亮 王德田

［摘要］ 目的

探討環保脫蠟液對壞死性肉芽腫性炎石蠟切片的抗酸染色效果。

方法 回顧性收集病理診斷結果為壞死性肉芽腫性炎的163例組織標本作為研究對象，分別使用二甲苯（二甲苯組）和環保脫蠟液（環保脫蠟液組）作為切片的透明脫蠟液。采用齊-內抗酸染色法檢測兩組切片的結核分枝桿菌，比較兩組切片的抗酸染色效果、結核分枝桿菌陽性率和數量及兩組切片的結核分枝桿菌的符合率和診斷吻合系數。

結果 兩組切片抗酸染色均背景清晰，呈灰藍色；細胞核藍色，胞漿粉紅色；結核分枝桿菌清晰可見，呈鮮紅色；肺泡腔內壁見粉染滲出物。環保脫蠟液組切片的結核分枝桿菌陽性率高于二甲苯組，差異有統計學意義（χ2=105.20，P＜0.001）。兩組切片的結核分枝桿菌符合率為87.12%，結核分枝桿菌診斷吻合度較強且差異有統計學意義（kappa=0.723，P＜0.001）。環保脫蠟液組檢出的結核分枝桿菌均數高于二甲苯組，差異有統計學意義（t=40.106，P＜0.001）。

結論

與二甲苯相比，使用環保脫蠟液有利于提高壞死性肉芽腫性炎石蠟切片的結核分枝桿菌抗酸染色檢出率和數量。

［關鍵詞］ 壞死性肉芽腫性炎；抗酸染色；結核分枝桿菌

［中圖分類號］ R365

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0890-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.181

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20231220.2243.005;2023-12-22 10：34：05

ACID-FAST STAINING EFFECT OF ENVIRONMENTAL FRIENDLY DEWAXING SOLUTION FOR NECROTIZING GRANULO-

MATOUS INFLAMMATION

LI Ting， WANG Ling， HU Jiali， YANG Yang， WANG Liangliang， WANG Detian

（Department of Pathology， Jiujiang University Affiliated Hospital， Jiujiang 332000， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the acid-fast staining effect of environmental friendly dewaxing solution for paraffin sections of necrotizing granulomatous inflammation.

MethodsA total of 163 tissue sections of pathologically diagnosed necroti-

zing granulomatous inflammation were retrospectively divided into two groups： using either xylene or environmental friendly dewaxing solution as transparent dewaxing solution. The Ziehl-Neelsen method was used to detect tuberculous mycobacteria in both groups. The two groups were compared in the acid-fast staining effect and the positive rate and number of tuberculous mycobacteria. The coincidence rate and coincidence coefficient for tuberculous mycobacteria detection of the two groups were calculated.

ResultsThe acid-fast-stained sections in both groups showed a clear gray-blue background; blue nuclei surrounded by pink cytoplasm; clearly visible bright red tuberculosis mycobacteria; and pink-stained exudates inside the wall of the alveoli. The positive rate of tuberculosis mycobacteria in the environmental friendly dewaxing solution group was significantly higher than that of the xylene group （χ2=105.20，P<0.001）. The coincidence rate of tuberculosis mycobacteria between the two groups was 87.12%. The coincidence degree of tuberculous mycobacteria detection was relatively high， which was statistically significant （kappa=0.723，P<0.001）. The mean number of tuberculosis mycobacteria detected in the environmental friendly dewaxing solution group was significantly higher than that in the xylene group （t=40.106，P<0.001）.

ConclusionCompared with using xylene， the use of environmental friendly dewaxing solution can help improve the positive rate and number of tuberculous mycobacteria detected with acid-fast staining in paraffin sections of necrotizing granulomatous inflammation.

［KEY WORDS］necrotizing granulomatous inflammation; anti-acid staining; mycobacterium tuberculosis

結核是嚴重危害人類健康的主要傳染?。?］。我國第五次結核病流行病學調查發現，結核病年發病100萬例，發病率為78/10萬［2］。結核病的病原菌90%以上為結核分枝桿菌，因其菌體壁上含有脂質，一般染料不易著色，但是經過抗酸染料染色后呈紅色，且可抵抗鹽酸乙醇的脫色［3］。病理學檢查是診斷結核病的重要途徑，尤其在痰菌陰性肺結核和肺外結核等疑難診斷中有重要作用［4］。最經典的結核分枝桿菌病理學檢查方法是齊-內染色法。脫蠟是切片進行特殊染色的必須步驟，傳統脫蠟液二甲苯能溶解石蠟。但是由于二甲苯的毒性作用大，可對操作人員造成危害［5］；而且二甲苯會造成脂質和菌體壁溶解，導致結核分枝桿菌結果為假陰性［6］，故齊-內染色法檢測結核分枝桿菌過程中不建議使用二甲苯脫蠟。因此，尋找一種環保、高效脫蠟而又能保護結核分枝桿菌的組織處理液是必要的。本文探討環保脫蠟液對壞死性肉芽腫性炎石蠟切片的抗酸染色效果?，F將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑及儀器 40 g/L甲醛中性固定液購于南昌雨露實驗器材有限公司；二甲苯購于天津市恒興化學試劑制造有限公司；石碳酸復紅病理抗酸染色液購于珠海貝索生物技術有限公司；BLB-01生物組織樣本切片染色脫蠟液（環保脫蠟液）購于北京九州柏林生物科技有限公司。ASP300S 全封閉式組織脫水機、HistoCore Arcadia H石蠟包埋系統、HistoCore BIOCUT 切片機和DM2000 LED生物顯微鏡購于德國徠卡公司；DRS-Prisma-P-JCS全自動染色封片一體機購于日本櫻花公司。

1.1.2 標本及其來源 回顧性收集2016年1月—2022年3月九江學院附屬醫院送檢、病理證實為壞死性肉芽腫性炎，并且具有結核分枝桿菌抗酸染色結果（使用二甲苯作為透明脫蠟液，二甲苯組）的163例組織標本作為研究對象，對其留存蠟塊重新切片后再次進行抗酸染色（使用環保脫蠟液作為透明脫蠟液，環保脫蠟液組）。163例病人中男86例，女77例，年齡6.59～75.68歲，平均（43.95±10.96）歲。組織來源部位：肺組織62例，淋巴結29例，胸膜及纖維板16例，腋下包塊15例，腸及腸黏膜9例，腹部包塊6例，頸部包塊5例，輸卵管5例，大網膜3例，乳腺3例，膝關節3例，扁桃體2例，睪丸2例，子宮內膜2例，后腹膜腫物1例。

1.2 研究方法

1.2.1 組織標本的前期處理 病理組織離體后30 min內放入40 g/L甲醛中性固定液中固定12 h，

常規組織取材，放入脫水機中進行固定、脫水、透明、浸蠟等步驟。程序如下：40 g/L甲醛中性固定液固定2 h；梯度乙醇脫水（體積分數0.75乙醇脫水70 min，體積分數0.80乙醇脫水70 min，體積分數0.85乙醇脫水60 min，體積分數0.90乙醇脫水60 min，體積分數0.95乙醇脫水60 min，體積分數1.00乙醇Ⅰ脫水60 min，體積分數1.00乙醇Ⅱ脫水50 min），二甲苯Ⅰ透明50 min，二甲苯Ⅱ透明40 min；石蠟Ⅰ浸蠟45 min，石蠟Ⅱ浸蠟45 min，石蠟Ⅲ浸蠟45 min，石蠟Ⅳ浸蠟30 min。

1.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 組織切片于65 ℃烤箱中烤片30 min，然后進行HE染色：二甲苯Ⅰ脫蠟5 min，二甲苯Ⅱ脫蠟5 min；體積分數1.00乙醇Ⅰ脫二甲苯2 min，體積分數1.00乙醇Ⅱ脫二甲苯2 min，體積分數0.95乙醇Ⅰ脫二甲苯和水化2 min，體積分數0.95的乙醇Ⅱ脫二甲苯和水化2 min，體積分數0.80乙醇脫二甲苯和水化1 min；水洗1 min；蘇木精染色8 min；水洗1 min；體積分數0.01鹽酸乙醇分化2 s；水洗2 s；氨水返藍10 s；水洗1 min；50 g/L伊紅染色2 min；水洗2 s；體積分數0.80乙醇脫水30 s，體積分數0.95乙醇Ⅰ脫水2 min，體積分數0.95乙醇Ⅱ脫水2 min，體積分數1.00乙醇Ⅰ脫水3 min，體積分數1.00乙醇Ⅱ脫水3 min；二甲苯Ⅰ透明4 min，二甲苯Ⅱ透明4 min，二甲苯Ⅲ透明4 min；中性樹膠封片，顯微鏡下觀察HE染色結果。壞死性肉芽腫性炎的組織學診斷由兩位資深病理醫師共同完成。

1.2.3 齊-內法檢測結核分枝桿菌 將組織學診斷結果為壞死性肉芽腫性炎的蠟塊制作6 μm厚的切片，使用環保脫蠟液進行脫蠟（10 min×3次），水洗，滴加石碳酸復紅溶液于切片上，65 ℃烤箱里加熱至冒蒸汽后停止加熱；染色5～10 min，水洗，將水分瀝干或以濾紙吸干，

滴加酸性乙醇溶液脫色1～

2 min，水洗（若切片上還有紅色殘存，則滴加酸性乙醇溶液作用至紅色消失，然后繼續水洗），滴加蘇木精25 s，水洗；吹干切片水分，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察染色結果。實驗過程中設置了不含結核分枝桿菌的陰性對照和含結核分枝桿菌的陽性對照。

1.2.4 結核分枝桿菌染色結果觀察 結核分枝桿菌抗酸染色呈鮮紅色，多數為桿狀、稍彎曲；少數菌體較長者可呈螺旋狀、兩端稍鈍，背景呈灰藍色，細胞核藍色，胞漿粉紅色，肺泡內壁見粉染滲出物。參照相關文獻標準［4］，在400倍顯微鏡下觀察50個視野，未找到結核分枝桿菌判讀為陰性，發現1條以上的結核分枝桿菌判讀為陽性。

1.3 統計學處理

采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，數據間比較采用t檢驗；計數資料以百分數表示，數據間比較采用χ2檢驗。診斷吻合度采用kappa系數檢驗，kappa≥0.7表示吻合度

較強；0.7＞kappa≥0.4表示吻合度一般，kappa＜0.4示吻合度較弱。P<0.05表示差異有顯著意義。

2 結? 果

2.1 兩組結核分枝桿菌的抗酸染色效果比較

顯微鏡下觀察，二甲苯組和環保脫蠟液組石蠟切片結核分枝桿菌抗酸染色的背景清晰，呈灰藍色；細胞核藍色，胞漿粉紅色，結核分枝桿菌清晰可見，呈鮮紅色；6例肺結核重癥病人的肺泡內壁見粉染滲出物，可能是肺透明膜形成（圖1A1、A2、B1、C1、C2）。二甲苯處理組有19例未見結核分枝桿菌（圖1B1），改用環保脫蠟液處理后切片可見鮮紅色結核分枝桿菌（圖1B2）；二甲苯組結核分枝桿菌陽性的切片（圖1C1）改用環保脫蠟液處理后，結核分枝桿菌的數量增加（圖1C2）。

2.2 兩組結核分枝桿菌陽性率、符合率及診斷吻合度比較

二甲苯組和環保脫蠟液組切片的結核分枝桿菌陽性率分別為30.67%（50/163）、41.10%（67/163），環保脫蠟液組切片的結核分枝桿菌陽性率高于二甲苯組，差異有統計學意義（χ2=105.20，P<0.001）。兩組切片的結核分枝桿菌符合率為87.12%（（48+94）/163）。見表1。二甲苯組和環保脫蠟液組切片的結核分枝桿菌診斷吻合系數kappa=0.723，吻合度較強，差異有統計學意義（P<0.001）。

2.3 兩組切片結核分枝桿菌均數比較

二甲苯組和環保脫蠟液組切片結核分枝桿菌均數分別為（235.68±45.11）、（592.06±49.28）條，差異有統計學意義（t=40.106，P<0.001）。

3 討? 論

為鑒別可疑凝固性壞死和結核樣結節，了解結核病變中結核分枝桿菌存在的情況和病變情況，常需做結核分枝桿菌的特殊染色檢測，即抗酸染色。結核分枝桿菌菌體內含有脂質、蛋白質和多糖，并由糖脂形成一個蠟質的外殼，該外殼能與齊-內染色法的石碳酸復紅溶液結合成復合物，該復合物能抵抗酸性乙醇溶液脫色，因此，該方法染色能把結核分枝桿菌清晰顯示出來。

結核分枝桿菌檢出率偏低仍然是目前大多數醫院普遍存在的病理難題。一個非常重要的原因就是使用的透明脫蠟液不恰當。為解決這一學科問題，本研究通過對比二甲苯和環保脫蠟液用于壞死性肉

芽腫性炎石蠟切片的抗酸染色效果，探討一種環保而恰當的透明脫蠟液。本文研究結果顯示，兩種方法抗酸染色的形態效果均能達到三甲醫院診斷的要求，19例經二甲苯處理后未見結核分枝桿菌的切片，改用環保脫蠟液后切片出現了鮮紅色結核分枝桿菌。說明二甲苯用于新鮮組織脫蠟的結核分枝桿菌檢出率不及回顧性石蠟切片使用的環保脫蠟液。原因可能是因為二甲苯脫蠟溶解了菌體脂質，損傷了菌體壁結構，進而造成了抗酸菌的抗酸性減弱甚至消失。相關研究顯示，使用環保型脫蠟劑替代二甲苯脫蠟效果佳，抗酸染色的結果與二甲苯脫蠟效果非常接近［7］。本文研究二甲苯組和環保脫蠟液組切片的抗酸染色并非同一時間段完成，環保脫蠟液組的切片是對留存蠟塊重新切片后再次行抗酸染色，側重于追蹤環保脫蠟液對放置了一段時間蠟塊的抗酸染色效果。

石蠟的化學結構為直鏈烷烴，二甲苯的化學結構為環族芳香烴化合物；本研究使用的環保脫蠟液的主要成分是異丙醇，化學式是C3H8O，為無色透明液體。透明脫蠟遵循的原理是“相似相溶”，本文以石蠟的直鏈烷烴為基準，與二甲苯相比，環保脫蠟液的結構與石蠟的結構更相似，因此，環保脫蠟液與石蠟的互溶性更大。本研究結果顯示，環保脫蠟液組切片結核分枝桿菌的形態學、陽性率和數量均優于二甲苯組，證實了環保脫蠟液透明脫蠟效果更優。有研究應用病理組織環保透明劑、汽油、松節油和GSA-08脫蠟劑代替二甲苯進行脫蠟處理，結果顯示，病理組織環保透明劑抗酸染色效果最佳［8］。本文結合二甲苯組和環保脫蠟液組切片的結核分枝桿菌陽性率、符合率和診斷吻合系數以及結核分枝桿菌均數等指標，從多個維度探討了環保脫蠟液用于壞死性肉芽腫性炎病理石蠟切片抗酸染色性能，結果顯示，盡管石蠟切片已經放置了一段時間，但是使用環保脫蠟液作為石蠟切片的處理液，對結核分枝桿菌的檢出率和檢出數量優于二甲苯的處理效果。說明環保脫蠟液在溶解石蠟的同時，維系了菌體壁的結構完整性，因此，對于石蠟切片結核分枝桿菌的檢測效果更優。

本研究結果顯示，環保脫蠟液組的結核分枝桿菌陽性率為41.10%，與相關研究報道的37.19%～58.00%陽性率基本一致［9-10］。此外，為論證環保脫蠟液的實用性，本文比較了兩組結核分枝桿菌的數量的差異，這在國內外文獻中尚未見報道。受研究時限和標本來源于單中心以及標本數量的限制，本研究可能存在一定的抽樣誤差；陽性率與標本本身的含菌量也密切相關，故本文結論可能存在一定的局限性。環保脫蠟液越來越被眾多實驗室使用，我們下一步的研究目標是進一步加大多中心實驗室的科研合作力度，盡可能收集更多經痰涂片檢查和聚合酶鏈式反應等技術方法確診的結核標本，對比和驗證環保脫蠟液制作的石蠟切片結核分枝桿菌陽性率和數量的檢測效果，以排除假陽性和發現更多的真陰性病例，為臨床的精準診療提供有力依據。

［參考文獻］

［1］JOV N， MASDEU E， BRUGUERAS S， et al. Threats and interventions during the treatment of tuberculosis in an inner-city district［J］.? Archivos De Bronconeumologia， 2021，57（5）：330-337.

［2］高磊，張慧，胡茂桂.全國結核分枝桿菌潛伏感染率估算專家共識［J］. 中國防癆雜志，2022，44（1）：4-8.

［3］YELAMANCHI S D， SUROLIA A. Targeting amino acid metabolism of Mycobacterium tuberculosis for developing inhibitors to curtail its survival［J］.? IUBMB Life， 2021，73（4）：643-658.

［4］陳昕，王晨，陳琦，等.? 一種新型抗酸染色陽性對照在病理診斷中的應用［J］.? 臨床與實驗病理學雜志， 2022，38（1）：117-118.

［5］于靜，江思瑜，田俊杰，等.? 正丁醇聯合松節油替代二甲苯用于石蠟包埋［J］.? 解剖學報， 2022，53（1）：132-135.

［6］張麗榮，趙小輝，李婷，等.? PDCA循環管理在病理石蠟組織抗酸染色中的應用［J］.? 臨床與實驗病理學雜志， 2020，36（7）：865-866.

［7］薛曉偉，王德田，李星奇. 環保脫蠟劑在抗酸染色中的使用效果比較［J］.? 診斷病理學雜志， 2018，25（2）：157，161.

［8］賴英榮，梁英杰，楊詩聰. 四種脫蠟透明劑在抗酸染色中的比較研究［J］.? 臨床醫學工程， 2012，19（2）：252-253.

［9］齊興峰，鄭巧靈，朱育連，等.? EDTA修復后金胺O染色提高石蠟組織切片結核分枝桿菌的檢出率［J］.? 臨床與實驗病理學雜志， 2015，31（10）：1187-1189.

［10］MA S， HUANG Y， XIE F L， et al. Transport mechanism of Mycobacterium tuberculosis MmpL/S family proteins and implications in pharmaceutical targeting［J］.? Biological Chemistry， 2020，401（3）：331-348.

（本文編輯 黃建鄉）