有關“篩選”的問題歸類分析

曹建平

(江蘇省南通市海安市曲塘中學)

高中生物學育種、基因工程、細胞工程、發酵工程等教學內容中都涉及“篩選”問題,高考題和模擬題也常以其作為命題素材,本文對“篩選”問題簡要歸納并結合例題進行分析。

一、育種中的篩選

為獲得所需要的生物類型,在雜交育種、誘變育種、單倍體育種等過程中都要進行篩選。在雜交育種過程中,為選育出符合要求的顯性純合子,可讓具有顯性性狀的個體連續自交,直到不再發生性狀分離為止。

【例題1】(2014年江蘇卷,T13)圖1是高產糖化酶菌株的育種過程,有關敘述錯誤的是

( )

圖1

A.通過圖1篩選過程獲得的高產菌株未必能作為生產菌株

B.X射線處理既可以引起基因突變也可能導致染色體變異

C.圖1篩選高產菌株的過程是定向選擇過程

D.每輪誘變相關基因的突變率都會明顯提高

【解析】由于X射線處理導致的基因突變具有隨機性,所以篩選獲得的高產菌株也可能存在其他的基因突變而不能作為生產菌株,選項A正確;X射線處理可以引起基因突變,也可能造成染色體結構變異,選項B正確;題圖1是高產糖化酶菌株的育種過程,是定向篩選高產菌株的過程,選項C正確;因為基因突變的隨機性、低頻性以及不定向性,所以不是每輪誘變相關基因的突變率都會明顯提高,選項D錯誤。

【答案】D

【例題2】(2018年江蘇卷,T8)花藥離體培養是重要的育種手段。圖2是某二倍體植物花藥育種過程的示意圖,下列敘述正確的是

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圖2

A.為了防止微生物污染,過程①所用的花藥需在70%乙醇中浸泡30 min

B.過程②的培養基中需添加較高濃度的細胞分裂素以利于根的分化

C.過程③逐步分化的植株中可篩選獲得純合的二倍體

D.過程④應將煉苗后的植株移栽到含有蔗糖和多種植物激素的基質上

【解析】為了防止微生物污染,培養所用的花藥(外植體)需在70%乙醇中浸泡30 s,立即用無菌水清洗2～3次。在70%的乙醇中浸泡30 min,細胞會死亡,選項A錯誤;過程②是脫分化,培養基中應加入比例適中的生長素和細胞分裂素以達到脫分化的效果,選項B錯誤;由于用秋水仙素可以誘導細胞中染色體數加倍,所以過程③逐步分化的植株中可篩選獲得純合的二倍體,選項C正確;煉苗的目的是使幼苗適應外界的環境。煉苗后,應洗去根部富含有機物的培養基,栽種到以無機營養為主的普通基質上,選項D錯誤。

【答案】C

二、微生物的篩選

自然界中微生物種類龐雜,有時候人們會發現一些特殊功能的微生物,為了將該類微生物分離出來并使用,就需要對其進行篩選。借助選擇培養基,依據不同類型微生物的特性,通過改變培養基的成分等來實現篩選出人類需要的某種微生物。

【例題3】(2014年全國新課標卷Ⅰ,T39,節選)植物秸稈中的纖維素可被某些微生物分解?；卮鹣铝袉栴}:

(3)為從富含纖維素的土壤中分離獲得纖維素分解菌的單菌落,某同學設計了甲、乙兩種培養基(成分如表):

酵母膏無機鹽淀粉纖維素粉瓊脂CR溶液水培養基甲++++-++培養基乙+++-+++

據表判斷,培養基甲________(填“能”或“不能”)用于分離和鑒別纖維素分解菌,原因是________;培養基乙________(填“能”或“不能”)用于分離和鑒別纖維素分解菌,原因是________。

【解析】(3)培養基甲中未添加瓊脂,為液體培養基,液體培養基上不能形成單菌落,故不能用于分離和鑒別纖維素分解菌。培養基乙中未添加纖維素粉,不能和CR溶液形成紅色復合物,即使出現單菌落也不能確定為纖維素分解菌。

【答案】(3)不能 液體培養基不能用于分離單菌落 不能 培養基中沒有纖維素,不會形成CR-纖維素紅色復合物,即使出現單菌落也不能確定其為纖維素分解菌

三、細胞工程中的篩選

(一)植物體細胞雜交技術中的篩選

植物體細胞雜交技術中涉及原生質體的融合過程,在融合細胞中有同種和異種融合兩種類型,因此涉及對雜種細胞的篩選。

【例題4】(改編)實驗人員利用矮牽牛(二倍體,2n=14)的紅色花瓣細胞(液泡呈紅色)與枸杞(四倍體,4n=48)葉肉細胞,制備相應的原生質體并誘導其融合,經篩選、培養獲得雜種植株。下列有關敘述正確的是

( )

A.酶解法制備原生質體的主要原理是酶的高效性

B.原生質體培養在無菌水中可以避免雜菌污染

C.若原生質體兩兩融合,融合細胞染色體數均為62條

D.可利用光學顯微鏡觀察,篩選出雜種細胞

【解析】誘導植物細胞融合前,先去除細胞壁,獲得原生質體。因為植物細胞的細胞壁主要成分是纖維素和果膠,所以用纖維素酶和果膠酶處理,這里依據的是酶的專一性,選項A錯誤;原生質體沒有細胞壁,培養在低濃度溶液(無菌水)中會吸水漲破,應該在等滲溶液中培養,選項B錯誤;若原生質體兩兩融合,會形成3種細胞,即矮牽牛細胞自身融合的細胞、枸杞細胞自身融合的細胞以及雜種細胞,故融合細胞中染色體數目可能為28條、96條、62條,選項C錯誤;因為雜種細胞中既含有綠色的葉綠體(葉肉細胞含葉綠體),也含有紅色的液泡,所以可以用光學顯微鏡觀察細胞的顏色進而篩選出雜種細胞,選項D正確。

【答案】D

(二)單克隆抗體制備中的篩選

在單克隆抗體制備過程中,經誘導融合劑處理后的細胞需要進行兩次篩選。首先,B淋巴細胞與骨髓瘤細胞在滅活的仙臺病毒或聚乙二醇(PEG)等方法的誘導下融合后,混合物中有多種類型的細胞,包括未融合的B淋巴細胞、未融合的骨髓瘤細胞、兩個B淋巴細胞融合形成的融合細胞、兩個骨髓瘤細胞融合形成的融合細胞、B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞,以及3個(含)以上細胞融合成的融合細胞。其中雜交瘤細胞是制備單克隆抗體所必需的,因此,需要進行第一次篩選,從多種細胞中篩選出雜交瘤細胞。

又因為B淋巴細胞是從動物體內提取的,有的可能是動物體內曾接觸過其他抗原刺激而分化產生的,只具有分泌其他抗體的能力;有的并未接受抗原刺激,未分泌抗體;只有一部分B淋巴細胞是接受了實驗用的抗原刺激能分化產生漿細胞,能分泌目標抗體。又因為很多抗原具有多個不同的抗原決定簇,所以這些接受了實驗抗原刺激的B淋巴細胞分化產生的漿細胞產生的抗體也不是單一的,受該抗原刺激后的每個B淋巴細胞都能產生一種只針對某抗原決定簇的抗體。因此,需要進行第二次篩選,即從眾多雜交瘤細胞中篩選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞。

【例題5】(2020年全國卷Ⅰ,T38,節選)為研制抗病毒A的單克隆抗體,某同學以小鼠甲為實驗材料設計了以下實驗流程。

圖3

回答下列問題:

(3)為了得到能產生抗病毒A的單克隆抗體的雜交瘤細胞,需要進行篩選。圖3中篩選1所采用的培養基屬于________,使用該培養基進行細胞培養的結果是____________。圖3中篩選2含多次篩選,篩選所依據的基本原理是____________。

【解析】圖3中篩選1采用特定的選擇培養基,在該培養基上,未融合的細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡,只有融合的雜種細胞(雜交瘤細胞)才能生存。圖3中篩選2含多次篩選,利用抗原與抗體特異性結合的原理,就可獲得能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。

【答案】(3)選擇培養基 只有雜交瘤細胞能夠生存 抗原與抗體的反應具有特異性

【知識拓展】(1)HAT培養基:細胞DNA的合成有兩條途徑,一條途徑是生物合成途徑(D途徑),由糖和氨基酸合成核苷酸,進而合成DNA,葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是應急途徑或補救途徑(S途徑),在次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)存在的情況下,經次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用下生成相應的核苷酸,然后再合成DNA。

HAT培養基中含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。未融合的淋巴細胞和2個B淋巴細胞相互融合形成的融合細胞雖S途徑正常,但因缺乏在體外培養液中增殖的能力,一般10d左右死亡。對骨髓瘤細胞以及自身融合細胞而言,通常實驗采用的骨髓瘤細胞是次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷型細胞,由于自身沒有S途徑,且D途徑又被氨基喋呤阻斷,所以在HAT培養液中不能增殖而很快死亡。只有雜交瘤細胞,既具有B淋巴細胞的S途徑,又具有骨髓瘤細胞在體外培養液能無限增殖的特性,因此能在HAT培養基中存活和增殖。

(2)有限稀釋法:二次篩選通常采用有限稀釋克隆細胞的方法,將雜交瘤細胞充分稀釋,接種在多孔細胞培養板上,使每孔內細胞不超過一個,通過培養讓其增殖,然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體(常用酶聯免疫吸附試驗法),上清液可與特定抗原結合的培養孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞,繼續進行有限稀釋,一般重復3～4次,直至確定每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞株。

四、基因工程中的篩選

由于目的基因與載體正確連接效率、重組質粒導入細胞的效率都不是百分之百,導致受體細胞經轉化處理后,絕大部分仍是原來的細胞,或者是只含質粒的細胞。為了分離出含目的基因的受體細胞,需要對處理過的大量受體細胞進行篩選和鑒定。

【例題6】(2016年新課標Ⅰ卷,T40,節選)某一質粒載體如圖4所示,外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因,Tetr表示四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切后,與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合,加入DNA連接酶進行連接反應,用得到的混合物直接轉化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉化,有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種,分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}:

(2)如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選,在上述四種大腸桿菌細胞中,未被轉化的和僅含有環狀目的基因的細胞是不能區分的,其原因是________;并且________和________的細胞也是不能區分的,其原因是________。在上述篩選的基礎上,若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌的單菌落,還需使用含有________的固體培養基。

【解析】(2)依題意可知,目的基因插入后,導致四環素抗性基因(Tetr)失活,而氨芐青霉素抗性基因(Ampr)仍能行使正常功能。用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選,未被轉化的和僅含有環狀目的基因的細胞均不含氨芐青霉素抗性基因,在該培養基上都不能生長,所以是不能區分的;含有質粒載體和含有插入了目的基因的重組質粒的細胞都含氨芐青霉素抗性基因,在該培養基上都能生長,也是不能區分的。在上述篩選的基礎上,若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落,還需使用含有四環素的固體培養基;因目的基因插入后,導致四環素抗性基因(Tetr)失活,含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌在該培養基中不能生長,而含有質粒載體的則能正常生長。