白念珠菌與角質形成細胞相互作用的研究進展

房曉雅 楊靜

(山西醫科大學第二臨床醫學院皮膚性病科,太原 030001)

1 白念珠菌對角質形成細胞的黏附和侵襲

在皮膚念珠菌病中,角質形成細胞(keratinocytes,KC)往往是白念珠菌侵襲表皮的主要靶細胞。白念珠菌可以通過形態轉換以及表達黏附素和侵襲素與KC黏附或相互作用,通過分泌相關的蛋白酶直接進入細胞內,或通過與宿主細胞表面相關配體結合誘導內吞作用進入細胞損傷KC。

1.1 磷酸甘油酸突變酶1 (phosphoglycerate mutase 1,Gpm1)

Gpm1作為一種真菌黏附素,介導了真菌的免疫逃逸、黏附、侵襲和定植。Gpm1在于真菌的表面及其胞質中,可以與補體系統的調節因子H因子/H因子結合樣蛋白1(FHL1)結合介導補體C3b的降解。Gpm1還可與纖溶酶原結合,在尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPa)作用下,激活的纖溶酶降解宿主細胞外基質蛋白和補體C3b,有助于白念珠菌免疫逃逸[1]。

Crisanto等[2]通過研究發現Gpm1存在于白念珠菌的表面,且參與白念珠菌與KC和內皮細胞的黏附過程。通過對人體細胞外基質蛋白的分析鑒定找到了其配體——玻連蛋白(vitronectin),二者呈劑量依賴性結合。玻連蛋白存在于KC的表面,是細胞外基質的一個組成部分,同時也是末端補體通路的調節因子。Gpm1與KC的黏附是白念珠菌向深層組織侵襲的前提。gpm1Δ/Δ突變菌株與KC的黏附系數明顯降低。

1.2 抗原6(antigen 6)

A型白念珠菌(C.albicansA)具有一種特定的抗原,抗原6,它存在于A型白念珠菌細胞壁的甘露聚糖中[3]。早期研究發現,A型念珠菌細胞壁甘露聚糖特異性側鏈即抗原6,可以介導其與人口腔頰黏膜上皮細胞的黏附。隨后Bramono等[4]用單克隆抗體6篩選抗原6缺陷突變菌株(MY4-24)以及抗原6陽性的親本菌株(MI012R)通過與人KC共孵育,用掃描電鏡觀察A型念珠菌細胞壁的抗原6對KC的黏附作用。研究表明,抗原6缺陷突變株的黏附率明顯低于抗原6陽性的親本菌株,表明人KC表面存在與A型念珠菌抗原6結合的相關受體。

1.3 整合素樣蛋白

白念珠菌的整合素樣蛋白在結構和功能上都與人的β2整合素的α亞基相似(αM和αX,分別被稱為CD11b和CD11c)[5]。整合素可以識別Arg-Gly-Asp(RGD)序列;白念珠菌的整合素樣蛋白結構與白細胞黏附糖蛋白(β2整合素)結構不同,除了其α亞基可以識別RGD序列外,其自身也含有RGD序列。白念珠菌表面的整合素樣蛋白通過識別上皮細胞合成的iC3b分子中的RGD序列介導黏附[6]。 Ollert等[7]通過將白念珠菌分別與多種衍生的含有RGD序列的合成肽以及KC共孵育,合成的多肽RGD和RGDS沒有顯示出任何抑制作用,僅用PepTite-2000觀察到較為顯著的抑制作用。

1.4 分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartic proteinase,Saps)

Saps是白念珠菌分泌的一系列蛋白水解酶,由10個成員組成,Sap1-10[8],在黏附和侵襲宿主細胞的過程中發揮著重要作用。Sap1-8經白念珠菌分泌釋放到周圍的介質中,而Sap9和Sap10都有典型的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)蛋白質C末端共同序列,可與細胞表面結合[9-10]。

早期研究中發現白念珠菌分泌的Sap1-3在皮膚黏膜的感染過程中有顯著作用,盡管白念珠菌感染皮膚和口腔黏膜的過程中都表達了相同的SAP,但表達的順序在黏附和侵襲過程中有所不同。Schaller等[11]通過重組人上皮的口腔念珠菌病體外模型和應用RT-PCR,展示出白念珠菌感染口腔黏膜過程中SAP基因表達的先后順序(SAP1和SAP3>SAP6>SAP2和SAP8)。隨后通過菌株SC5314感染重組人表皮的皮膚念珠菌病體外模型中觀察到SAP1和SAP2、SAP8、SAP6、SAP3[12]在皮膚念珠菌感染過程中的進行性表達。起初觀察到淺表KC的病理變化的同時,檢測到SAP1和SAP2的表達。當白念珠菌向角質層深部侵襲伴隨SAP8的表達。隨后當白念珠菌進入棘層和顆粒層并伴隨芽管的生成時,可檢測到SAP6的表達。Δsap1和Δsap2突變菌株與親本菌株SC5314的感染相比,兩種突變體對組織的損傷顯著降低。同樣,在該模型中使用特異性天冬氨酸蛋白酶抑制劑胃抑素A(pepstatin A)后,白念珠菌對KC的黏附和損傷程度大大降低[7],證實了Saps對皮膚損傷的重要作用。

1.5 溶細胞肽毒素(candidalysin)

近年來對于白念珠菌的毒力因子的廣泛研究證實了白念珠菌可以分泌一種溶細胞肽毒素,這是一種菌絲衍生的肽毒素,可以直接損傷宿主細胞,并通過雙相MAPK調節激活宿主細胞的免疫反應[13]。溶細胞肽毒素由菌絲形成相關基因ECEP1編碼, Ece1p被Kex2p[14]和Kex1p(二者均為存在于高爾基體中的蛋白酶)加工為成熟的溶細胞肽毒素。隨后驗證Ece1-III62-93K是Ece1p的活性區域,Ece1-III濃度累積到一定程度,可與細胞膜相互作用,形成孔狀結構,引發細胞膜損傷以及鈣離子內流,直接損傷宿主細胞。在小鼠口咽念珠菌病模型中,感染白念珠菌野生型或ECE1再整合(ece1Δ/Δ+ECE1)菌株的小鼠與ece1Δ/Δ小鼠相比,病理切片所顯示的白念珠菌的菌絲的侵襲以及組織損傷和中性粒細胞的浸潤更加顯著[15]。溶細胞肽毒素可誘導p-MKP1、c-Fos、細胞因子IL-1α和IL-6的產生以及上皮細胞損傷。Rebecca等[16]發現在皮膚真菌感染期間,皮膚KC中誘導了類似的效應反應,包括MAPK、MKP1、c-Fos、促炎基因和細胞因子的表達。但溶細胞肽毒素與皮膚KC的相互作用尚未具體闡明,仍需進一步的研究和探討。

1.6 糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAGs)

糖胺聚糖是由重復二糖單元構成的大線性多糖,含有氨基糖和糖醛酸。近來研究發現糖胺聚糖可與多種細胞因子及相關酶相互作用,參與致病菌與細胞的黏附、炎癥反應等[17]。Ordiales等[18]通過研究證實了GAGs參與了白念珠菌與KC黏附。羅丹明B可以抑制GAGs的合成,酵母相和菌絲相的白念珠菌與使用羅丹明B處理后的KC的黏附系數均顯著降低。硫酸肝素(HS)和硫酸軟骨素(CS) 作為結構不同的兩種GAGs對于白念珠菌的黏附作用也不同。用肝素酶I和III處理KC后,白念珠菌對KC的黏附反而增加。用硫酸軟骨素裂解酶(ABC)酶解CS的效果則相反：酵母相和菌絲相的白念珠菌對KC的黏附均顯著降低。對此猜測KC表面不同種類的GAGs可能以合作的方式參與白念珠菌與細胞的黏附,另外,GAGs的降解可能有利于白念珠菌與另一類細胞表面受體結合。在隨后的研究中發現,白念珠菌和表皮及真皮的細胞相互作用可調節參與HS和CS生物合成的基因的變化：在KC中CHPF出現下調,而在成纖維細胞中EXT1、EXT2、CHSY3和CHPF下調[19]。相關研究為抗白念珠菌黏附的發展開辟了新的途徑。

2 KC抗白念珠菌的免疫調節

在皮膚念珠菌病中,KC是組成表皮主要的細胞,構成了抗念珠菌感染的一道重要防線。近年來多項研究表明,KC具有免疫細胞的功能。KC可表達模式識別受體(PRPs)與念珠菌表達的病原體相關分子模式(PAMPs),如白念珠菌細胞壁中的β-葡聚糖,甘露聚糖等成分,二者相互作用進而激活宿主固有免疫反應。此外,KC也可產生趨化因子誘導特異性免疫。

2.1 誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase,iNOS)

NO是一種氧自由基,在人體各組織中均可生成并發揮作用,同樣在皮膚的先天免疫也起重要作用,NO不僅可以殺死病原體(如細菌、真菌等),還可以調節KC的遷移并促進皮膚傷口愈合[20]。iNOS產生的NO 主要有殺死病原體的非特異性免疫作用,細菌感染可增加iNOS表達和NO生成[21]。研究表明生理狀態下的KC即可表達較低水平的iNOS并產生NO[22-23],體外將白念珠菌與KC共孵育可上調iNOS mRNA和NO的生成,使用 L-NAME抑制iNOS,則KC對白念珠菌的殺傷作用大大降低,提示NO介導了KC殺死白念珠菌[24]。除此之外,NO通過cGMP/PKG-Rho GTP酶途徑介導HaCaT細胞遷移[20],促進受損皮膚的修復,iNOS基因缺失的小鼠皮膚傷口的修復和愈合延遲[25]。綜上,iNOS釋放NO不僅可以直接殺死白念珠菌,還可以通過促進KC的遷移加快皮膚念珠菌病皮損處的愈合。

2.2 抗菌肽(anti-microbial peptides,AMPs)

宿主在抵抗病原微生物入侵的過程中可產生抗菌肽, 由KC分泌的相關抗菌肽不僅可以直接殺死入侵的白念珠菌發揮天然免疫效應,還可以介導免疫細胞產生細胞因子,趨化因子以及促炎因子發揮特異性免疫作用。其中β-防御素是在皮膚免疫中最主要的抗菌肽[26-27]。人類β-防御素(human beta-defensin,HBD)是一種富含半胱氨酸,低分子量的陽離子多肽。Rozina[28]等驗證了正常人類皮膚KC可以表達HBD-2,白念珠菌感染KC后可檢測到hBD-2 mRNA的表達增加,且白念珠菌菌絲相誘導hBD mRNA上調的作用強于酵母相[29-30]。先前研究表明HBD通過影響白念珠菌細胞膜的通透性及其穩態進而起到直接殺傷作用,且該殺菌作用具有鹽敏感性,殺傷作用隨細胞外鹽濃度的升高而降低[31]。其中HBD-2和HBD-3對于白念珠菌有較強的殺傷作用,HBD-3殺傷作用更強約為HBD-2的10倍[32]。但隨后Slavena等[31]通過測定熒光染料鈣黃綠素的釋放量,檢測hBD-2和hBD-3誘導白念珠菌細胞膜損傷的能力發現HBD不會引起明顯的膜破壞和膜失穩。因此推測先前報道的細胞膜損傷可能是與防御素誘導的細胞死亡相關的次要效應。近期研究證實白念珠菌細胞壁成分磷酸甘露聚糖可以通過TLR2-NF-κB,p38MAPK 信號通路產生HBD-2,HBD-3參與皮膚抗白念珠菌免疫反應[33]。除了直接殺傷作用外,HBD-2通過與細胞表面趨化因子受體6(CCR6)相互作用,趨化樹突狀細胞和T細胞至感染部位,發揮特異性免疫作用[34]。

2.3 模式識別受體(PRPs)

甘露糖結合受體(mannose receptor,MR) 甘露聚糖是白念珠菌細胞壁的成分之一,也是皮膚免疫系統可識別的一種重要的病原體相關分子模式。甘露糖受體是一種C 型凝集素受體( C-type lectins receptor,CLRs),具有3個胞外結構域可以識別多種內源性和外源性配體,其中8個串聯的C型凝集素樣結構域(CLTD)可以識別病原體的相關分子模式,如白念珠菌細胞壁的甘露聚糖、細菌的脂多糖等[35-36]。MR主要是在單核細胞、巨噬細胞、DC 表達等免疫細胞中表達,且早期研究驗證了巨噬細胞甘露糖受體(MMR)對白念珠菌具有吞噬和殺傷作用,該作用可在IFN-γ的刺激下增強[37]。隨后Szolnoky等[38]利用甘露糖親和層析法從KC中分離出一種甘露糖結合受體,驗證了KC表面存在甘露糖結合受體(KcMR)并可介導KC殺傷白念珠菌。KcMR對白念珠菌的殺傷作用可被甘露聚糖和甘露糖基化的牛血清白蛋白(Man-BSA)抑制。KcMR除了介導對白念珠菌直接的殺傷作用,還可以通過誘導HBD-2產生介導對白念珠菌的間接殺傷作用[39]。

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs) TLRs作為一種重要的模式識別受體,在人體的固有免疫和特異性免疫中發揮著重要作用。目前已知的人類的TLRs家族共有11個成員,Lebre等人發現KC構成性地表達TLR1、2、3、4、5、6、9和10mRNA,而不表達TLR7和8[40-44]。TLRs通過與相應的配體結合激活信號通路MyD88(髓樣分化因子受體88)-I-RAKs(IL-1受體相關激酶家族)-TRAF6(TNF受體相關因子6)- NF-κB(或AP-1),使NF-κB發生核轉移介導轉錄產生不同的細胞因子和趨化因子。其中TLR4除了使用MyD88外,還使用一種稱為β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFN-β, TRIF)的適配器分子來啟動信號轉導[45]。

早期研究發現TLR2可以識別白念珠菌的磷脂甘露聚糖[46],TLR4可以識別O-連接甘露聚糖[47]。Pivarcsi等[48]證實白念珠菌可通過與TLR2或TLR4結合,激活KC的NF-κB發生核轉移。NF-κB是IL-8的重要調控因子,白念珠菌通過激活NF-κB誘導IL-8表達上調,不僅可以將血液中的白細胞募集至皮膚參與免疫反應,IL-8還增加了KC對念珠菌的殺傷活性。但該作用似乎并不依賴于KC中的TLR,而是依賴于NF-κB?？筎LR的抗體與KC預孵育并不能有效降低IL-8的表達,但使用柳氮磺胺吡啶抑制NF-κB,KC對白念珠菌殺傷作用大大降低。雖然抗TLR并不能抑制白念珠菌誘導的IL-8的上調,但TLR2抗體和TLR4抗體可抑制KC的念珠菌殺傷能力,因此推測百念珠菌誘導的KC中IL-8表達上調和KC殺死白念珠菌是通過不同的途徑介導的。

2.4 其他

除了上述所提及的各類抗菌肽以及模式識別受體外,KC還具有直接的殺念珠菌活性,可以通過紫外線[49-50]、IL-1[51]、IL-8和α-黑色素細胞刺激素[52]增加其活性。IL-1、前列腺素E2和血小板活化因子也已被證明參與了人表皮細胞對念珠菌的殺傷[53],但其殺傷機制尚不清楚。

3 小 結

白念珠菌作為條件致病真菌廣泛存在于正常人的皮膚、口腔、胃腸道、生殖道黏膜。由于長期濫用廣譜抗生素以及免疫抑制劑等,各種原因引起的皮膚黏膜屏障的損傷,或免疫功能下降而引發念珠菌病。盡管當前對于白念珠菌的致病因子及其誘導的免疫反應研究已經取得一定成果,但白念珠菌感染KC的相關靶點以及毒力因子研究仍有待進一步的發掘,KC所介導的固有免疫反應機制仍需進一步探討。