基于超高效液相色譜-質譜技術及網絡藥理學和分子對接探討柴芍胃炎顆粒治療慢性胃炎的有效成分及潛在作用機制

唐定洪 李能源 任維 梁盼 羅群 黃銳 蒲清榮 趙劍 任桂林

[關鍵詞]柴芍胃炎顆粒；超高效液相色譜-質譜；胃炎；網絡藥理學；分子對接

慢性胃炎（chronicgastritis，CG）指不同病因引起的各種慢性胃黏膜炎性病變，臨床上以上腹部疼痛、飽脹、燒灼感、反酸噯氣、食欲不振等癥狀多見，是一種常見病，“十人九胃病”，據世衛組織統計，胃病的發病率高達80%，且日趨年輕化，故而胃病已成世界之殤。而CG位居胃病之首，病情反復，影響患者生活質量，甚至導致胃癌的發生。在我國，基于內鏡診斷的CG患病率在90%左右[1]。

胃病的病機多為胃氣阻滯，胃失和降，不通則痛。若情志不暢，肝郁氣滯，肝胃不和，損傷脾胃，而中焦升降失調，運化不利，則胃脘部脹痛，故胃病與肝密切相關[2]。故將CG的病機概括為肝郁、胃熱、脾虛，治療以疏肝、清熱、補虛為主[3]。柴芍胃炎顆粒是西南醫科大學附屬中醫醫院（我院）醫療機構制劑，由柴胡、黃連、吳茱萸、白芍、莪術、丹參、延胡索、酒大黃、黃芪、木香等中藥制成，其中柴胡疏肝解郁，白芍柔肝止痛，黃連、吳茱萸清肝胃郁熱，木香行氣止痛，延胡索、丹參、酒大黃活血化瘀，黃芪補氣健脾，諸藥共奏疏肝和胃，清熱止痛的功效[4]，用于肝胃不和、肝胃郁熱所致的胃脘脹痛、灼痛噯氣、口干口苦、情志不暢加重等癥[5]。柴芍胃炎顆粒在我院已使用多年，臨床療效顯著，但作用機制仍不清楚。本研究借助網絡藥理學及分子對接對柴芍胃炎顆粒治療CG的成分及靶點進行預測，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Ultimate3000超高效液相色譜儀，美國Waters公司；LTQOrbitrapvelospro高分辨質譜儀，美國ThermoFisher公司。柴芍胃炎顆粒，西南醫科大學附屬中醫醫院制劑室，批號：20211115。

1.2 色譜及質譜條件

色譜條件：Hss-T3色譜柱（1.8μm，2.1mmID×150mm，Waters）；35℃柱溫；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～5min，2%B；5～8min，2%B→20%B；8～38min，20%B→55%B；38～45min，55%B→70%B；45～50min，70%B→80%B；50～56min，80%B→100%B；56～58min，100%B；58～58.5min，100%B→2%B；58.5～65min，2%B；流速0.2ml/min。質譜條件：電噴霧（ESI）離子源，加熱器溫度300℃，毛細管溫度350℃，毛細管電壓35V，噴霧電壓為±3.5kV，鞘氣（N2）流速35arb，輔助氣（N2）流速10arb；一級質譜正負離子模式全掃描，m/z掃描范圍100～1500，二級質譜數據依賴性掃描。

1.3 樣品的制備

取柴芍胃炎顆粒10g，加8倍量的水，超聲30min，過濾，濾液12000r/min離心20min，取上清液，即得供試品。

1.4 柴芍胃炎顆?；钚猿煞謾z索及靶點預測

檢索中藥系統藥理數據庫和分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）獲取柴芍胃炎顆粒中每味中藥的化學成分，以口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18作為條件篩選活性成分。在TCMSP中篩選出候選活性成分的靶點信息[6]。將靶點信息導入Uniprot數據庫統一基因名稱。

1.5 胃炎相關靶點的搜集

以“gastritis”“chronicgastritis”“chronicsuperficialgastritis”為檢索關鍵詞，分別通OMIM（https：//omim.org/），Drugbank（https：//go.drugbank.com/），DisGeNET（https：//www.disgenet.org/），GeneCards（https：//www.genecards.org/）數據庫獲取胃炎的相關靶點[7]。

1.6 “中藥-有效成分-治療靶點”網絡圖的構建

將化學成分的靶點與胃炎疾病的靶點取交集，作為柴芍胃炎顆粒治療胃炎的潛在作用靶點。將化學成分的靶點與潛在治療靶點相互映射，構建“中藥-有效成分-治療靶點”網絡[8]，并導入Cytoscape3.8.0進行可視化，計算網絡中節點的拓撲參數，篩選重要的化合物及作用靶點。

1.7 蛋白相互作用網絡的構建

將潛在作用靶點上傳到STRING11.0數據庫（https：//www.string-db.org/），構建蛋白相互作用網絡（PPI），并將此網絡導入Cytoscape3.8.0進行可視化，篩選重要的蛋白質[9]。

1.8 功能富集分析

應用R及Rstudio軟件對柴芍胃炎顆粒治療胃炎的潛在作用靶點的生物過程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）、細胞成分（cellcomponent，CC）和KEGG通路富集分析，運用KEGG數據庫（www.kegg.jp）繪制靶點作用通路，進一步揭示柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用機制[10]。

1.9 分子對接

通過pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫下載化學成分結構（.sdf），PDB（http：//www.rcsb.org/）數據庫下載靶點的結構。用DiscoveryStudio軟件分別對靶點結構進行去除結晶水、加氫等處理，將PPI中Degree值前10的靶點與“中藥-有效成分-治療靶點”網絡圖中Degree值前15的化學成分進行對接，以libdockscore值作為對接程度的評判標準。

1.10 中藥-歸經網絡的構建

通過檢索《中華人民共和國藥典》2020年版[11]，對柴芍胃炎顆粒中的中藥歸經進行整理，構建柴芍胃炎顆粒中藥-歸經網絡圖。

2 結果

2.1 柴芍胃炎顆粒主要化學成分

將柴芍胃炎顆粒供試品按照上述條件進行UPLC-HR-MS分析，利用XcaliburQualBrowser軟件及文獻鑒定化合物，圖1為正、負離子檢測模式下的柴芍胃炎顆粒色譜圖，成分鑒定結果見表1。

2.2 柴芍胃炎顆?；钚猿煞旨皩袠?/p>

通過檢索TCMSP數據庫并篩選，得到柴芍胃炎顆粒候選活性化合物249個，其中白芍7個、柴胡11個、大黃6個、丹參54個、黨參13個、莪術1個、甘草86個、黃連9個、黃芪16個、木香5個、吳茱萸24個、延胡索49個、枳殼5個，共有成分19個。對活性成分進行靶點預測，獲取靶點303個。

2.3 “中藥-有效成分-治療靶點”網絡

利用OMIM、Drugbank、DisGeNET、GeneCards數據庫獲取胃炎的相關靶點共計2060個。將成分靶點與疾病靶點取交集，共有134個交集靶點。將上述結果構建“中藥-有效成分-治療靶點”網絡，見圖2。圖中共有396個節點（中藥13個、成分249個、靶點134個），其中菱形代表治療靶點，上方圓形的代表共有化學成分，其余則代表中藥及各自中藥的化學成分。對節點拓撲參數進行分析，篩選網絡中關鍵的節點，Degree值在前10位的化合物分別是：槲皮素、木樨草素、山柰酚、川陳皮素、柚皮素、β-谷甾醇、芒柄花黃素、異鼠李素、甘草查爾酮A、丹參酮ⅡA，這些成分作用于胃炎的潛在靶點較多，說明這些成分與胃炎的靶點關系密切。Degree值在前10位的靶點分別是：PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、AR、NOS2、PPARG、CHRM3、ESR2、F2、GSK3B，說明柴芍胃炎顆粒治療胃炎與這幾個靶點相關性較大。

2.4 PPI網絡的構建

將134個交集靶點導入STRING數據庫，得到蛋白質間的相互作用信息，除了COA7靶點，其余靶點均具有相互作用。其Degree值較高的靶點為AKT1、IL6、TNF、TP53、IL1B、CASP3、JUN、PTGS2、MMP9、STAT3，其值分別為104、104、102、99、95、92、92、88、87、87。見圖3。

2.5 靶點富集通路分析

由GO富集分析結果可知，柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用靶點主要涉及的生物過程包括對脂多糖的反應，對細菌源性分子的反應，活性氧代謝過程和對氧化應激的反應等。分子功能主要包括細胞因子活性，DNA結合轉錄因子結合等。細胞組分主要涉及膜筏，膜微區等結果見圖4。KEGG富集分析P值最小的通路為脂質與動脈粥樣硬化通路，見圖5，在該通路中，淺色靶點代表該通路中最為關鍵的靶點。

2.6 分子對接

運用DiscoveryStudio軟件對靶點和化學成分進行分子對接，篩選對接分數值最高的靶點和其對應的化學成分，木犀草素、吳茱萸次堿、山柰酚等化學成分與靶點對接值較高，靶點中PTGS2、CAPS3等靶點對接分數值最高，其中PTGS2與木犀草素、吳茱萸次堿、山柰酚對接分數值達到了130，分子對接圖見圖6，表明這幾個分子具有的潛在作用活性強。

2.7 中藥-歸經網絡的分析

中藥-歸經網絡圖中有11味中藥均歸脾經，有8味中藥歸肝經，有6味中藥歸胃經，可見柴芍胃炎顆粒的主要作用部位在脾、肝、胃，這與柴芍胃炎顆粒的功效主治一致，見圖7。

3 討論

本研究借助網絡藥理學，初步探討了柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用機制。分子對接的結果表明PTGS2與木犀草素、吳茱萸次堿、山柰酚對接分數值較高，起主要作用。PTGS2、PTGS1又分別名為COX-1、COX-2，是花生四烯酸轉化為前列腺素代謝中的關鍵酶。PTGS1參與前列腺素的成分生成，特別是在胃和血小板中，是胃上皮細胞產生前列腺素和血小板產生血栓素A2（TXA2）的關鍵步驟。PTGS2在平滑肌及絕大多數被生長因子、細胞因子或激素刺激的組織中表達，負責產生炎癥性前列腺素，參與細胞生長、PG的產生等生物過程。通過降低PTGS2的表達起到抗炎作用[16]。因此，柴芍胃炎顆粒治療胃炎的靶點主要與抗炎、細胞增生等機制相關。

本研究運用超高效液相色譜-串聯質譜技術、網絡藥理學和分子對接的方法，對柴芍胃炎顆粒的多成分-多靶點的復雜網絡關系進行探究，初步闡釋了柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用機制，為探索藥效物質基礎和作用機制提供了方向。