生脈散對2 型糖尿病模型大鼠糖脂代謝和腸道菌群的影響

丘文龍，彭瑜威，楊心怡，譚曉君，張雪楊，趙文昌，吳都督，盧洪梅，劉小柳，阮永隊*，陳稚*（.廣東醫科大學藥學院，廣東東莞 5808；.廣東醫科大學附屬東莞第一醫院，廣東東莞 570；.中國深圳市深圳羅湖人民醫院醫學實驗室，廣東深圳 5800）

2 型糖尿?。═2DM）是危害人類健康的重大疾病，其病死率在腫瘤、心血管之后居第三位，是目前備受全球關注的公眾衛生問題。在我國T2DM 的患病率高達11.6%，T2DM 的防治已成為研究熱點[1-2]。目前T2DM 的發病機制較為復雜，但普遍認為胰島素抵抗是T2DM 的主要發病機制。而腸道菌群與糖尿病的發生、發展密切相關，腸道菌群在胰島素抵抗的發生、發展過程中發揮了至關重要的作用[3-6]。因此，靶向調控腸道菌群及其代謝產物，調節腸道菌群的穩態，被認為是治療T2DM 的有效手段。

另外，在中醫理論中，糖尿病屬于“消渴病”范疇，是以氣陰虛弱為本，燥熱熾盛為標的一種慢性發展性疾病。不少研究表明，生脈散能有效改善胰島素抵抗，明顯改善T2DM 患者的臨床癥狀和體征[7-9]。目前生脈散改善胰島素抵抗的作用機制并未明了，本研究將從腸道微生態的角度探討生脈散調節糖脂代謝治療 T2DM 的可能作用機制，旨在為其臨床應用提供理論和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選擇SD 大鼠70 只，雄性，SPF 級，身體質量（100.0±10.0）g，由廣東醫科大學院動物實驗中心提供，許可證號碼SCXK（粵）2013-0008。所有動物均在無病原體的環境中飼養并隨意喂食。照顧和使用動物的程序得到廣東醫科大學動物中心倫理委員會的批準，并遵守了有關動物道德使用的所有適用的機構和政府法規。

1.1.2 藥物與試劑 受試藥物：生脈散，藥物組成按照普通高等教育中醫藥類規劃教材 《方劑學 》第五版所載 : 人參、麥冬、五味子按3∶3∶2 比例組成，本實驗中取人參9 g、麥冬9 g、五味子6 g，以上藥物麥冬和五味子以10 倍量水煎煮1.5 h 后，人參10 倍水另煎1.5 h 后濾出藥液和其余藥物藥液混合、過濾，濃縮至0.5 g/mL。用藥劑量依據2015 年版《中華人民共和國藥典》，根據人和動物體表面積折算的等效劑量比率表計算，用藥總量為200 mg/kg，將該劑量設為中劑量，低、中、高劑量分別為50.0、200.0、400.0 mg/kg。對照藥物：（1）鹽酸二甲雙胍，250 mg/片，河北天成藥業有限公司，國藥準字H20031134，按照臨床常用劑量換算后給動物灌服，劑量為4.0 mg/kg；（2）辛伐他汀，20 mg/片，浙江京新藥業股份有限公司，國藥準字H20000009，按照臨床常用劑量換算后給動物灌服，劑量為0.32 mg/kg。采用葡萄糖氧化酶測定試劑盒、胰島素放免試劑盒、大鼠胰島素試劑盒、DNA 提取試劑盒（美國Cayman 試劑公司）、鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司）。

1.1.3 主要儀器 AUW120D 電子分析天平，Shimadzu 公司，日本；DYCP-24DN 電泳儀，北京六一儀器廠，中國；TQ8040 氣相色譜-質譜儀，日本島津公司；MiSeq PE300 高通量測序平臺，美國Illumina 公司。ABI 9700 逆轉錄PCR 儀，ABI 公司，美國；PikoReal熒光定量PCR 儀，Thermo Scientific 公司，美國；iMark 酶標儀：美國Bio-Rad 公司。

1.2 造模與分組

大鼠飼養于廣東醫科大學院動物實驗中心，室內溫度（25±2）℃，濕度50%～70%，采用12 h∶12 h 晝夜間斷照明，每天給予換水1 次，定量添加飼料1 次，并及時更換墊料次，動物自由飲水進食，維持飼料由廣東醫科大學動物實驗中心提供，進行適應性喂養1 周后，按隨機區組法分為正常組10 只，造模組60 只。造模組用高糖高脂飼料（豬油∶蔗糖∶奶粉∶雞蛋∶常規飼料=10∶20∶4∶3∶63）持續喂養8 周并結合腹腔注射30 mg/kg 鏈脲佐菌素誘導大鼠制備成糖尿病模型，正常組動物腹腔注射等劑量的生理鹽水作為對照。

1.3 干預方法

選取造模成功的實驗性糖尿病大鼠隨機分組，共分為正常組、模型組、二甲雙胍組（4.0 mg/kg）、辛伐他汀組（0.32 mg/kg）、生脈散低劑量組（50.0 mg/kg，L-SMS）、生脈散中劑量組（200.0 mg/kg，M-SMS）和生脈散高劑量組（400.0 mg/kg，H-SMS），每組10 只。給藥組每日上午定時灌胃給藥，模型組和正常組用等劑量（1 mL/100 g）的生理鹽水灌胃，連續6 周，期間配合普通飼料喂養。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 血清FBG、FINS、HbAlc 的檢測 所有動物在取標本前均禁食并自由飲水，禁食12 h 后，采用剪尾法從尾靜脈末梢取血0.2 mL 收集于干燥試管中，3 000 r/ min 離心15 min 后，取血清用于檢測。檢測藥物干預后的空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）及糖化血紅蛋白（HbAlc）的水平，其中FBG 使用葡萄糖氧化酶試劑盒檢測，FINS 采用胰島素放免試劑盒檢測，血清中HbAlc 使用相關試劑盒進行檢測。

1.4.2 血脂水平的檢測 測量完小鼠空腹血糖后，從小鼠眼球部取血，取血后采用頸椎脫臼方法處死小鼠。全血室溫靜置3 h，以3 000 r/min 離心15 min，緩慢輕柔吸取上層血清樣品，利用試劑盒及酶標儀分析血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平。

1.4.3 DNA 提取和測序 采用DNA 提取試劑盒提取各組小鼠結腸及盲腸內容物中的微生物總DNA。對樣品進行 PCR 擴增、產物純化、文庫制備與庫檢及 Miseq 上機測序。利用 overlap 將雙端數據進行拼接，并進行質控、嵌合體過濾，獲得高質量的有效數據。由于序列數量龐大，本試驗對最終獲得的有效數據進行 97% 的相似度聚類，為降低假陽性率，會過濾 singleton 序列，獲得最終的 OTU 豐度及代表序列，進一步進行多樣性分析、主坐標分析分析（principal coordinates analysis，PCoA）及微生物菌屬組成差異分析等。

1.4.4 短鏈脂肪酸含量的測定 從收集的糞便中取0.1 g 置于2 mL 離心管中，加500 μL 的飽和氯化鈉溶液，在冰浴條件下用打碎機打碎均勻，再加20 μL 10% H2SO4溶液，混合器振蕩混勻，到通風櫥中加 500 μL 無水乙醚，混合器振蕩混勻，14 000 r/min 離心15 min，取上清液置于裝有0.25 g 無水硫酸鈉的2 mL離心管中，再以同樣的條件離心，取上清液置于氣相瓶中待測。

1.5 統計學處理

應用SPSS 26.0 軟件進行統計學處理，計量資料以均數± 標準差表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生脈散對大鼠血糖的影響

與正常組比較，模型組大鼠的FBG、FINS、HbAlc水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，生脈散不同劑量組的FBG、FINS、HbAlc 水平均降低（P<0.01 或0.05），且其降糖作用隨劑量增加而增加，尤其是生脈散高劑量組，其效果與二甲雙胍組接近，提示生脈散可降低胰島素抵抗大鼠的血糖水平。見表1。

表1 生脈散對大鼠血糖的影響（,n=10）

表1 生脈散對大鼠血糖的影響（,n=10）

與正常組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.01，cP<0.05；與二甲雙胍組比較：dP<0.01；與生脈散低劑量組比較：eP<0.01，fP<0.05

2.2 生脈散對大鼠血脂水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠的模型組TC、TG、LDL-C 水平升高（P<0.01），HDL-C 水平降低（P<0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組和生脈散不同劑量組的TC、TG、LDL-C 水平降低，HDL-C 水平升高（P<0.01或0.05）；尤其是生脈散高劑量組，其降脂效果與辛伐他汀組基本一致，提示生脈散能夠改善高脂飲食誘導的小鼠血脂紊亂的現象。見表2。

表2 生脈散對大鼠血脂的影響（，n=10）

表2 生脈散對大鼠血脂的影響（，n=10）

與正常組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.01，cP<0.05；與辛伐他汀組比較：dP<0.01，eP<0.05；與生脈散低劑量組比較：fP<0.01，gP<0.05

2.3 生脈散對大鼠腸道菌群多樣性及組成的影響

正常組、模型組、生脈散低劑量組和生脈散高劑量組分別觀測到1 034、755、894 和971 個特有OTU數。與正常組比較，模型組的OTUs 數下降；而在大鼠接受不同劑量的生脈散后，OUTs 數目較模型組有一定程度提高。這表明生脈散有利于腸道菌群的恢復，豐富腸道菌群數。見圖1。

圖1 大鼠腸道菌群OTUs 分布的Venn 圖

Alpha 多樣性主要與種類數目和多樣性相關，即豐富度和均勻性。菌群豐富度主要包括 Chao1 指數，而菌群均勻性主要包括Shannon 和Simpson 指數。與正常組相比，模型組的 Shannon 以及 Chao1 指數均降低（P<0.01），而生脈散組與模型組相比，能有效升高Chao1、Shannon 與Simpson 指數（P<0.01）。上述結果表明，生脈散可以有效防止糖尿病大鼠的腸道微生物群豐富度及多樣性的降低。見表3。

表3 生脈散對大鼠腸道菌群Alpha 多樣性的-影響（，n=10）

表3 生脈散對大鼠腸道菌群Alpha 多樣性的-影響（，n=10）

與正常組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.01

為比較微生物群落之間的差異，計算了β 多樣性并進行主成分分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），其結果如圖2 所示。從圖2 可見，橫坐標和縱坐標成分的貢獻率分別是45.39%和13.28%，提示分組關系較好。而各組（正常組、模型組、生脈散低劑量組和生脈散高劑量組）樣本點區別明顯，其中生脈散低劑量組和生脈散高劑量組與正常組樣本點距離小于模型組和正常組間的距離，說明生脈散干預后的菌群結構有向正常組的菌群結構模式調節的趨勢。

圖2 大鼠腸道菌群β 多樣性的PCoA 圖

為進一步評估腸道微生物群的組成變化，進行了門水平的分類學分析。在門水平上，與正常組比較，模型組腸道菌群中放線菌門和變形菌門豐度升高，厚壁菌門和擬桿菌門豐度降低（P<0.01）。而與模型組相比，生脈散組使厚壁菌門、擬桿菌門和疣微菌門豐度升高，放線菌門和變形菌門豐度降低（P<0.01 或0.05）。這表明生脈散可在一定程度上改善糖尿病大鼠體內腸道菌群紊亂的狀態，誘導其腸道微生物組成恢復成正常大鼠狀態。見表4。

表4 生脈散對大鼠腸道菌群基于門水平的物種構成影響（，n=10，%）

表4 生脈散對大鼠腸道菌群基于門水平的物種構成影響（，n=10，%）

與正常組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.01，cP<0.05

2.4 生脈散對大鼠糞便中短鏈脂肪酸含量的影響

采用高效液相色譜法，考察了生脈散對大鼠糞便中SCFAs 含量的影響。結果發現，經灌胃高劑量生脈散后，大鼠糞便中的水分含量高于正常組，表明生脈散可能具有一定的潤腸通便的功能；另外，大鼠糞便中SCFAs 的含量較正常組和模型組均有增加，表明生脈散能有效促進大鼠腸道內產SCFAs 細菌的增殖，增加SCFAs 的產生量。見表5。

表5 生脈散對大鼠糞便中SCFAs 含量的影響

3 討論

隨著人們生活方式尤其是飲食習慣的變化，使得諸如冠心病和糖尿病之類的慢性代謝性疾病發病率增加[10]。糖尿病是由于體內胰島素分泌缺陷而引發的以高血糖為特征的代謝性疾病，其中90%以上患者為T2DM。而胰島素抵抗被認為是造成T2DM 的主要病理基礎和發病機制。近年來，中藥復方因具有多成分、多靶點、毒性低、價格低、整體調節糖代謝、改善胰島素抵抗的作用而成為了研究熱點[11-13]。且臨床研究已證明，生脈散對糖尿病及其并發癥有良好的防治作用[14]。本研究以傳統的中藥為切入口，使用生脈散對T2DM模型大鼠進行治療，從腸道微生態的角度探討生脈散調節糖脂代謝治療 T2DM 的可能作用機制。

本實驗結果顯示，生脈散可以降低T2DM 模型大鼠的血糖以及HbAlc 水平，也可以調節血脂水平。同時通過16SrDNA 高通量測序法研究腸道微生物，大鼠腸道菌群的OTUs 分布結果顯示，與正常組比較，模型組腸道菌群Chao1、Shannon、Simpson 指數均降低，表明模型組的腸道菌群豐度、多樣性均有降低；而生脈散低劑量與高劑量組中，Chao1、Shannon、Simpson指數明顯回調，提示生脈散對腸道菌群結構的多樣性有顯著改善且效果良好。此外，β 多樣性的PCoA 圖顯示，生脈散低劑量和高劑量組之間相互聚攏，表明生脈散低、高劑量這兩組在相應的維度上菌群群落組成相似；而且生脈散低、高劑量兩組有向正常組靠近的趨勢，提示大鼠腸道菌群的結構組成，在生脈散的干預下可以在一定程度上往正常大鼠菌群的結構組成回調。

此外，據文獻報道在T2DM 患者腸道內，厚壁菌門與擬桿菌門的比值與血糖水平呈正相關，而且這兩門菌群也是影響能量代謝平衡的主要群落[15-18]。因此我們在門水平上評估了腸道微生物的群落變化，結果顯示，與正常組比較，模型組的腸道菌群中放線菌門和變形菌門豐度明顯增加，擬桿菌門降低。作為腸道微生態失調的潛在生物標志物，變形菌門相對豐度增加與體內代謝紊亂有關聯，這一結果證實了模型組大鼠體內出現了腸道菌群失調[19]。經生脈散干預后，厚壁菌門、擬桿菌門和疣微菌門豐度升高，變形菌門豐度降低，說明生脈散對T2DM 大鼠腸道菌群有一定改善作用。最后，本實驗還考察了大鼠糞便中SCFAs 含量。SCFAs 主要包括乙酸、丙酸和丁酸，丙酸是擬桿菌門發酵的主要產物，可抑制膽固醇合成，丁酸是厚壁菌門發酵的主產物，可維持腸道內環境穩定[20]。本研究結果顯示，模型組大鼠的SCFAs 含量較正常組少，而生脈散組SCFAs 含量顯著回調且高于正常組，表明生脈散可使產SCFAs 的菌群豐度增加。

綜上，生脈散能顯著調節T2DM 模型大鼠的血糖、HbAlc 和血脂水平，且能增加腸道厚壁菌門、擬桿菌門和疣微菌門的豐度，降低變形菌門的豐度，生脈散改善糖脂代謝的機制可能與調節體內腸道菌群的結構密切相關。