淋病奈瑟菌感染小鼠脾臟單個核細胞對NLRP3、IL-1β 表達的影響

魏 娜，張方，李街青，陳佳玲，史建強*，陳嶸祎*（.南方醫科大學皮膚病醫院，廣東廣州 5009；.廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江 5400）

淋病是由淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，Ng）感染引起的性傳播疾病[1]，該菌感染常引起模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）激活。PRRs 包括Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）、C型凝集素受體（C-type lectin receptors，CLR）、RIG-I樣受體（RIG-I-like receptors，RLRs）、NOD 樣受體（NOD-like receptors，NLRs）、AIM2 樣受體（Aim2-like receptors，ALRs），可識別入侵微生物表達的病原相關分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）及組織損傷釋放的內源性危險相關分子模式（Damage-associated molecular patterns，DAMPs）。其中TLRs、NLRs 在細菌感染中研究較多，而NLRP3 是屬于NOD 樣受體的一種，細菌感染可激活宿主免疫細胞NLRP3 來上調IL-1β 以抵抗感染。體外細胞實驗研究Ng 的感染條件與宿主引起免疫應答對該病致病機制研究非常關鍵，然而Ng 體外感染單核細胞實驗最佳活菌含量罕見報道，本文通過研究Ng 定量方法以及不同含量Ng 感染單個核細胞對IL-1β、NLRP3 表達的影響，為后續體外Ng 感染免疫實驗研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 致病菌和C57/BL6J 小鼠 淋病奈瑟菌菌株，購于上海宜醇化工有限公司，菌種編號19424；C57/BL6J 小鼠，購于廣東省醫學動物中心。

1.1.2 主要儀器與試劑 SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司），酶標儀、CO2培養箱（美國Thermo SCIENTIFIC），高速低溫臺式離心機（美國Thermo），VininTM7 Dx Real-Time PCR 儀（美國Life），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），分光光度計（德國Eppendorf），電泳槽（美國Thermo），轉膜槽（美國Bio-Rad），Azure C500 多功能分子成像分析儀（美國Thermo），小鼠單個核細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），淋病奈瑟菌選擇培養基（江門凱林公司），澳洲源胎牛血清（美國Gibco），RPMI 1640 完全培養基、PBS 緩沖液（美國Gibco），Trizol（美國Ambion），qRT-PCR 試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMII 試劑盒（日本TaKaRa），RIPA 裂解液（10×）、蛋白酶/ 磷酸酶抑制劑cocktail（100×）、兔抗GAPDH抗體、兔抗IL-1β 抗體、抗兔IgG、HRP-linked 抗體（美國Cell Signaling Technology），兔抗NLRP3 抗體（英國Abcam），紅細胞裂解液（1×）、NuPAGE TM10% Bis-Tris Gel 膠、MES-SDS Running Buffer（20×）（美國Invitrogen），immobilon Western HRP 底物（美國Millipore）、Braford 蛋白濃度測定試劑盒（去垢劑兼容型）（中國碧云天有限公司），TBS 干粉（中國博士德生物有限公司），70 μm 孔徑尼龍細胞篩（美國Corning），脂多糖LPS（美國Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 菌液OD 值測定 將Ng 接種于Ng 選擇培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，用接種環挑取單個菌落于含10%胎牛血清的1640 培養液中制成細菌懸液。以未加菌的培養液為空白對照液調零，波長450 nm 測量OD 值，選取OD 值在0.6～1.0 之間的菌液進行1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0梯度稀釋，并測量其OD450值。

1.2.2 菌落平板計數 將按1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0 梯度稀釋的各組菌液進行10、102……10n倍比稀釋，吸取1 mL 稀釋后的菌液均勻涂布于固體培養基上，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。選取培養基上菌落數為30～300 個對應的稀釋倍數為最佳稀釋倍數，準確計數培養基上菌落數，再乘以稀釋倍數10n，為1 mL 菌液中的活菌數（CEU/mL），即菌液中Ng 活菌的含量。

1.2.3 回歸方程計算 以菌落數為y值，菌液OD450值為x 值，計算相關回歸方程。

1.2.4 小鼠脾臟單個核細胞獲取 于超凈工作臺中無菌操作取出C57/BL6J 小鼠脾臟，以PBS 漂洗2 次后，以磨砂玻片輕輕研磨，用細胞篩過濾獲得懸濁液4 mL。將此懸濁液移至已盛有單個核細胞分離液的離心管中，懸濁液與單個核細胞分離液體積之比為1∶4，以500×g 離心30 min，分4 層，取上數第2 層，即單個核細胞層。加入適量PBS 液漂洗1 次，加入紅細胞裂解液2 mL，吹打混勻2 min，再加入PBS 漂洗1次即可獲得高純度的單個核細胞。

1.2.5 RT-qPCR 檢測單個核細胞中 IL-1β、NLRP3 mRNA 表達水平 將OD450值為0.2、0.6、1.0、1.4 的Ng 懸液與單個核細胞置于含10% 胎牛血清的1640培養基中共培養1、2、6、12 h，此為實驗組；設置不加入Ng 的空白對照組計OD450值為0。培養結束后，采用梯度離心去除Ng，收集單個核細胞。運用Trizol 法提取細胞總RNA，采用隨機引物法反轉錄為cDNA，以SYBR Green 核酸染料為熒光探針，用Real-time PCR檢測細胞IL-1β、NLRP3 的mRNA 表達。選取上調IL-1β、NLRP3 mRNA 表達量最高的 OD450值的Ng 懸液與單個核細胞置于含10%胎牛血清的1640 培養基中共培養，并設立脂多糖LPS 單陽性對照組，在培養0、1、2、6、12、24 h 后分別收集單個核細胞，并采用梯度離心去除Ng。同樣運用Trizol 法提取細胞總RNA，采用隨機引物法反轉錄為cDNA，以SYBR Green 核酸染料為熒光探針，用Real-time PCR 檢測細胞IL-1β、NLRP3 mRNA 表達量。每個樣品均設置3 個復管，重復試驗3 次。分別測定對照組和試驗組目的基因與內參基因的Ct 值，實驗結果取其均值，采用2—△△CT法對各組基因 mRNA 表達水平進行相對定量分析。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計，序列如下：IL-1β-F：5’CTGCTGGTGTGTGACGTTC C3’IL-1β-R：5’ATATGGGTCCGACAGCACGA3’；NLRP3-F：5’TGCACACAGTGGTGTTCCAG3’NL RP3-R：5’TCACCTCTCGGCAGTGGATA3’；GAP DH-F：5’TGCACCACCAACTGCTTAG3’GAPDH-R：5’GGATGCAGGGATGATGTTC3’。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測 IL-1β、NLRP3 表達 選取上調IL-1β、NLRP3 mRNA 表達水平最高的OD450值的Ng 懸液與單個核細胞置于含10% 胎牛血清的1640 培養基中共培養，并設立脂多糖LPS 單陽性對照組，在培養0、1、2、6、12、24 h 后分別收集單個核細胞，并采用梯度離心去除Ng。收集細胞懸液，通過裂解、離心留取上清作為樣品，使用Bradford 蛋白測定法檢測總蛋白濃度。等量蛋白質上樣、電泳、轉膜，5% BSA 的TBST 封閉液室溫緩慢搖動60 min。TBST 液快速洗滌5 min，重復3 次。加入一抗（工作液濃度為1∶1 000）室溫搖床孵育2 h，4 ℃過夜，洗膜，孵育二抗，洗膜，顯影。結果分析：以GAPDH 為內參，比較目的蛋白表達水平。

1.2.7 統計學處理 以SPSS13.0 軟件進行統計學處理，計量資料以x-±s表示，使用單因素方差分析及q檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建立NgOD450 值（x）-活菌數（y）回歸方程

經過計數培養基上菌落數目，選擇最佳稀釋倍數為106，計數此稀釋倍數下不同OD 值菌液接種于固體培養基上的菌落數，計算OD 值與活菌數的回歸方程（表1）。

表1 Ng 菌落平板計數

2.2 不同含量Ng 懸液感染單個核細胞對IL-1β、NLRP3 mRNA 表達水平的影響

實時熒光定量PCR 相對定量分析顯示，將菌液OD450值為0 的空白對照組IL-1β、NLRP3 mRNA 表達量設為1，實驗組IL-1β、NLRP3 mRNA 相對表達量隨Ng 含量升高出現先升高后下降的趨勢，菌液OD 值為0.2 的實驗組IL-1β mRNA 相對表達量最高（P<0.01），見表2。OD 值為0.2 的實驗組NLRP3 mRNA 相對表達量也最高（P<0.01），見表3。

表2 不同含量Ng 感染單個核細胞中IL-1β 的mRNA 水平（，n=9）

表2 不同含量Ng 感染單個核細胞中IL-1β 的mRNA 水平（，n=9）

在相同時點：與A 組比較，aP<0.01；與B 組比較，bP<0.01

表3 不同含量Ng 感染單個核細胞中NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

表3 不同含量Ng 感染單個核細胞中NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

在相同時點：與A 組比較，aP<0.01；與B 組比較，bP<0.01

2.3 Ng 感染單個核細胞不同時間點的IL-1β、NLRP3表達

實時熒光定量PCR 相對定量分析顯示，將培養時間為0 h 的IL-1β、NLRP3 mRNA 表達量設為1，余時間點的IL-1β、NLRP3 mRNA 表達量隨著培養時間延長出現先升高后下降的趨勢，在培養1 h 后，IL-1β、NLRP3 mRNA 相對表達量最高（P<0.01），見表4；Western Blot 結果顯示相同的變化趨勢（圖1）。單陽性對照組的實時熒光定量PCR 結果提示IL-1β、NLRP3 mRNA 表達量隨著培養時間延長出現先升高后下降的趨勢，在培養1 h 后，IL-1β、NLRP3 mRNA相對表達量最高（P<0.01），見表5；Western Blot 結果顯示LPS 可上調IL-1β 分泌，隨著時間推移沒有出現降低趨勢，NLRP3 隨著時間推移出表達量有所降低（圖2），推測與蛋白翻譯滯后于mRNA 轉錄且NLRP3 是IL-1β 上游蛋白有關。

圖1 Ng 感染單個核細胞不同時間后單個核細胞中IL-1β、NLRP3 水平

圖2 LPS 單陽性對照組中IL-1β、NLRP3 水平

表4 Ng 感染單個核細胞不同時間后 IL-1β、NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

表4 Ng 感染單個核細胞不同時間后 IL-1β、NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

在同組中：與0 h 比較，aP<0.01；與1 h 比較，bP<0.01

表5 LPS 單陽性對照組中IL-1β、NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

表5 LPS 單陽性對照組中IL-1β、NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

在同組中：與0 h 比較，aP<0.01，bP<0.05；與1 h 比較，cP<0.01

3 討論

淋病由Ng 感染所致，是第二常見的細菌性性傳播疾病[2]。既往認為大多數淋球菌性泌尿生殖道感染的男性患者大多數是有癥狀的，而女性患者大多數為無癥狀感染[3-4]。然而有研究表明，Ng 的無癥狀感染在男、女性中均常見[5-6]。女性無癥狀淋病患者易延誤就醫，常繼發輸卵管炎、盆腔炎、不育甚至播散性淋病，并增加HIV 感染及傳播的概率[7]。迄今，無癥狀淋病的病因尚未完全闡明，且目前淋病的治療主要依賴注射用頭孢曲松，缺乏推薦使用的高質量抗菌藥物，Ng 逐漸形成抗生素耐藥，使得淋病的治療具有挑戰性和高度可變性[8]。由于受Ng 現有組織培養和動物模型系統的限制，Ng 賴以增殖復制的微環境的許多生態位未知[9]。因此，開展體外細胞實驗研究針對Ng 與宿主相關免疫應答機制具有一定的意義，然而尚無文獻為體外Ng 感染細胞實驗提供細菌含量和感染時間的參考依據。單個核細胞的分離技術便捷，使其成為眾多免疫感染實驗初步研究對象，本實驗以小鼠脾臟單個核細胞為實驗對象，研究Ng 對IL-1β、NLRP3 基因表達的影響，以期為后續感染實驗中選擇Ng 懸液含量和時間提供參考。

比濁計數是根據菌懸液的透光量間接地測定細菌的數量，細菌懸浮液的含量在一定范圍內與透光度成反比，與光密度成正比。因此，可用分光光度計測定菌液，用光密度（OD 值）表示樣品菌液含量。有研究者對采用紫外—可見分光光度法測定對細菌含量進行動態監測，在一定范圍內吸光度與細菌含量呈良好的線性關系[10-12]。但是比濁法只能測定相對細菌含量，不能得到確切活菌數值。本次試驗中，采用比濁法結合菌落平板計數法，測定一系列已知OD 值的菌懸液中活細菌數，作出光密度—活菌數標準曲線，進一步彌補比濁法計數的缺點，得到簡便快速細菌計數的方法，制備一系列不同含量的Ng 菌液。

Ng 有粘附宿主黏膜的特性，感染人類泌尿生殖道，主要引起局部黏膜固有免疫反應，并且可以反復感染，而不產生免疫記憶[9]。Ng 還能釋放肽聚糖片段、外膜囊泡（membrane vesicles，OMVs）和脂寡糖（lipo-oligosaccharide，LOS），從而激活TLRs、NLRs，誘導產生多種細胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等[13]。IL-1β 是一種高效的促炎細胞因子，對宿主防御感染和損傷至關重要。無癥狀的淋病患者宮頸分泌的IL-1β 比有癥狀的患者要少得多[14]。NLRs 是一種細胞內固有免疫受體，可識別和觸發細菌感染的炎癥[15]，而炎癥是一種限制微生物感染的保護過程。NLRP3炎癥小體是細胞溶質多蛋白復合物，由傳感蛋白NLRP3、接頭蛋白-凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）組成，充當著固有免疫系統傳感器[16]。NLRP3 可以被多種激活物激活包括ATP、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、尼日利亞菌素（nigericin）[17]。Ng 可激活NLRP3 炎癥小體，被觸發后，炎癥小體通過激活Casp-1 切割IL-1β 前體、IL-18 前體，產生成熟IL-1β、IL-18，并誘導細胞焦亡（pyroptosis）[18]。有研究表明，黃體酮可抑制NF-κ B 信號通路并下調ROS，抑制Ng 誘導的NLRP3 的激活和IL-1β 的形成[19]。本實驗通過檢測被不同含量Ng 感染的單個核細胞中IL-1β、NLRP3 表達，發現在菌液OD450值為0.2，即活菌數為2.69×107 CFU/mL 時，單個核細胞IL-1β、NLRP3 mRNA 表達水平最高，可以推測在此含量下，單個核細胞對Ng 引起免疫應答效應較大，可以將此細菌含量進行后續體外針對Ng 免疫應答實驗。將Ng（OD450值=0.2）與單個核細胞進行連續時間培養，發現在1 h 后，單個核細胞IL-1β、NLRP3 基因相對表達量最高，推測在Ng 感染1 h 后單個核細胞的免疫效應較大。本研究為日后Ng 感染單核細胞實驗提供了可靠的活菌定量方法，為Ng 感染單個核細胞實驗提供了細菌含量和感染時間的參考依據，我們研究還發現LPS 刺激單個核細胞表達IL-1β、NLRP3 比較穩定，24 h 兩者仍表達較高，但活菌實驗12 h 后IL-1β、NLRP3 表達下降，考慮是活菌實驗時單核細胞殺滅Ng 后炎癥因子表達下降所致。筆者認為活菌實驗能更好模擬感染過程，更有利于觀察單核細胞抗Ng 感染動態過程，研究者應考慮不同需求選擇不同的實驗方法。