兩株蒜頭果內生木霉的物種鑒定及其對幼苗的促生作用研究

王俊威，雷小鈴，陳婉東，潘 悅，王 娟

（1.西南林業大學 地理與生態旅游學院，云南 昆明 650224；2.西南林業大學 林學院，云南 昆明 650224；3.西南林業大學 綠色發展研究院，云南 昆明 650224）

【研究意義】蒜頭果（Malania oleifera）屬鐵青樹科蒜頭果屬，主要分布于我國云南東南部廣南、富寧兩縣以及廣西西部的部分石灰巖地區，為國家Ⅱ級珍稀瀕危保護植物。蒜頭果種仁油中富含神經酸，該物質能促進受損神經組織的修復與再生，故而被譽為植物油中的“液體黃金”[1-2]。隨著蒜頭果市場前景和應用價值的不斷凸顯，云南省廣南、富寧兩縣積極開展蒜頭果人工種植，然而蒜頭果幼苗造林存活率及保存率較低，且易受多種病害侵染[3-4]，因此研究蒜頭果促進生長、提高抗性的方法是實現其種植產業持續健康發展的技術保障?！厩叭搜芯窟M展】在與植物長期的協同進化過程中，植物內生真菌成為決定植物健康和產量的關鍵因素之一，不僅與植物的營養攝取、生長發育及存活率緊密相關，也對植物免疫系統調節起著重要作用[5]。前期研究表明，木霉為蒜頭果內生真菌的優勢屬[6]。據報道，內生木霉可代謝產生吲哚乙酸（IAA）、細胞分裂素和類植物生長素等多種植物生長調節劑刺激植物生長，同時降低高濃度植物外源激素對寄主生長產生的抑制作用[7-9]。而且，內生木霉通過增加不溶性化合物的溶解性以及微量營養物質的可利用性，提高植物對礦質元素的攝取率[10-11]。大量研究表明，內生木霉可顯著促進植物的種子萌發、組織分化、根系生長以及生物量和產量的增加[12-14]。此外，內生木霉可通過增強植物抗氧化系統能力，有效清除活性氧或阻止活性氧的產生，提高宿主對生物和非生物脅迫的耐受力[15-16]?！颈狙芯壳腥朦c】目前國內外未見蒜頭果內生木霉對其幼苗生長發育和抗性水平有何影響的報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究將對前期分離獲得的兩株蒜頭果內生木霉進行物種鑒定，揭示其產IAA 及解鉀能力，并通過接種幼苗的生長性狀、生物量、葉綠素含量及抗氧化酶活性測定，綜合評價供試木霉的促生作用，為蒜頭果微生物資源利用及優質苗木培育提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 SF151 和SF231 于2019 年4 月分別采集自云南省文山州廣南縣健康蒜頭果植株的根和莖，從表面消毒后的樣品中分離獲得[6]。

1.1.2 供試苗木 2019年10月收集當年生大小一致且無病害癥狀的蒜頭果種子，用50%多菌靈可濕性粉劑浸泡30 min后無菌水漂洗自然風干，河沙經高壓滅菌后添加無菌水保持濕度，將浸泡后的種子置于河沙中沙藏4 個月待萌發。營養缽使用75%乙醇溶液表面消毒，將萌發的蒜頭果種子用滅菌混合基質（紅土∶腐殖土∶珍珠巖=3∶2∶1）單株種植于營養缽，定期澆無菌水保持營養缽中土壤濕潤，待蒜頭果長至6～8片葉時進行接種試驗。

1.2 供試菌株的種類鑒定

1.2.1 分子學鑒定 通過尿素提取法提取上述兩株真菌的DNA[17]，分別對其DNA 原液進行核糖體內轉錄間隔區（ITS）、轉錄延長因子（TEF）和RNA 聚合酶大亞基（RPB2）3 個基因片段的PCR 擴增，相關引物和PCR 反應條件參照Zhu等[18]和Chaverri等[19]。PCR 產物經凝膠電泳檢測送昆明碩擎生物科技有限公司進行雙向測序。

測序結果在CExpress 中手動拼接校正后經NCBI 比對，選出相似度較高且已發表的菌株作為參考，查閱文獻并下載參考序列基于最大似然法（ML）和貝葉斯法（BI）構建系統發育樹。使用jModelTest 2.1.4 構建最佳模型，系統發育樹在MrBayes 3.1.2 中采用Markov Chain Monte Carlo（MCMC）法構建，去除25%的最初結果，后驗概率經最終的貝葉斯系統樹計算[20]。最大似然法使用RAxML 分析，靴帶值重復計算1 000 次[21]。

1.2.2 形態學鑒定 將活化后的菌株轉接至玉米葡萄糖培養基（CMD）、馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）和低營養瓊脂培養基（SNA）平板，25 ℃條件下黑暗培養5～20 d后觀察菌落形態、質地以及顏色等特征。并用滅菌解剖針挑取SNA培養基上的氣生菌絲或皰狀結構制備水玻片，顯微鏡下觀察菌株的分生孢子梗、瓶梗、分生孢子形態及著生方式，每類結構測量30次。

1.3 促生功能測定

1.3.1 產IAA 能力測定 供試菌株活化后接種于PDB 液體培養基，經180 r/min，28 ℃，12 d 培養后抽濾菌絲收集發酵液。發酵液與Salkowski 比色液等比例混合后靜置30 min，根據顯色結果對菌株的產IAA 能力進行定性檢測?；旌弦侯伾缴?，表明其產IAA 能力越強。將顯色的發酵液與Salkowski 比色液等比例混合后采用紫外分光光度計測定其OD530，并通過繪制標準曲線計算供試菌株的產IAA活性。

1.3.2 解鉀能力測定 將木霉菌株接種于PDA 培養基中28 ℃暗培養7 d，用滅菌打孔器取直徑5 mm 的菌餅接種于解鉀培養基培養20 d，若菌餅周圍出現透明圈，表明該菌具有解鉀活性，測量透明圈直徑，并通過四苯硼酸鈉重量法測定菌株的解鉀能力[22]。

1.4 幼苗接種效應研究

取上述7 個菌餅接種于600 mL PDB 液體培養基，置于恒溫振蕩培養箱中180 r/min，28 ℃培養96 h，經無菌濾紙過濾并通過血球計數板統計將菌液濃度稀釋至1×106個/mL。

試驗設2 個處理組和1 個對照組，處理組每月通過灌根的方式定期施用50 mL 供試菌液，對照組施用等量無菌水，共處理6次，每處理20個重復。每處理隨機取10株幼苗測量施菌前和培養6個月后的幼苗株高、莖粗和葉片數，其中株高用鋼卷尺測量植株莖基部到莖尖的距離，葉片數為整株幼苗所有葉片的數量，莖粗用游標卡尺測定莖基部直徑。隨后將植株取出清水洗凈根部后自然風干，測定其鮮重，105 ℃殺青30 min，再65 ℃烘干至恒重后測定其干重。每處理另取10 株幼苗，采集第2～4 片功能葉測定其葉綠素含量、SOD 和POD 活性，其中葉片葉綠素含量采用乙醇浸提比色法進行測定[23]，葉片的SOD 和POD 活性參照羅陽蘭[13]進行測定，再將植株取出洗凈根部后統計單株吸器數量和最大吸器直徑。最后每株2 段總長6 cm 的側根，剪成1 cm 的根段通過KOH-臺盼藍染色法來觀察接種真菌在蒜頭果幼苗根部定殖情況并計算定殖率[24]。

1.5 數據統計

使用 SPSS25.0對不同處理間幼苗的生長性狀、生物量、葉綠素含量及抗氧化酶活性進行單因素方差分析，并對供試菌株接種幼苗后的各項測定指標進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 兩株蒜頭果內生木霉的物種鑒定

如圖1 所示，經ITS、TEF 和RPB2 3 個片段構建系統發育樹，SF231 與SF151 兩株菌分別位于兩個不同的分類單元。其中SF231 與T.koningiopsis聚為一支，與T.koningiopsisCEN1386 的貝葉斯和最大似然后驗概率分別達到1.00 和95。SF151 與T.gamsiiGJS04-09 位于相同支系，且貝葉斯和最大似然分別1.00和100。

圖1 基于ITS、TEF和RPB2聯合的貝葉斯系統發生樹Fig.1 Bayesian consensus tree generated from the DNA sequences of ITS，TEF and RPB2

如圖2 所示，SF151 在PDA 培養基上25 ℃培養7 d 后菌落呈白色，菌絲致密。在SNA 培養基中25 ℃菌落白色，在CMD 培養基上25 ℃培養，菌絲顏色較淺呈黃綠色。分生孢子梗樹狀，瓶梗中部略膨大，成對出現于單個或末端分枝，也會多個聚集，大小為（6.1-）7.1-10.5（-12.4）×（1.4-）1.8-2.3（-2.8）μm，長寬比（2.5-）3.7-4.9（-7.4）。分生孢子光滑，卵圓、橢圓或不規則橢圓形，大?。?.4-）2.7-3.9（-4.2）×（2.2-）2.3-2.9（-3.3）μm，長寬比（1.1-）1.2-1.4（-1.5）。

SF231 在PDA 培養基上25 ℃培養7 d 菌落呈淺灰至深灰，菌絲致密。在SNA 培養基中25 ℃培養菌落淺灰色，在CMD 培養基上25 ℃培養，菌落透明狀，邊緣皰狀結構聚合。分生孢子梗呈樹狀，瓶?；枯^窄，大小為（4.3-）5.4-9.6（-10.6）×（1.9-）2.0-2.4（-2.6）μm，長寬比（2.0-）2.2-4.7（-5.0），分生孢子光滑，橢圓形，大小為（2.8-）2.9-3.8（-4.2）×（2.2-）2.3-3.0（-3.2）μm，長寬比（1.0-）1.2-1.6（-1.7）。結合兩株內生木霉的系統

發育分析和形態學特征，將SF151和SF231分別鑒定為T.gamsii和T.koningiopsis。

2.2 兩株蒜頭果內生木霉的促生功能

2.2.1 蒜頭果內生木霉的產IAA 能力 如表1所示，IAA標準品與Salkowski比色液混合后顯色反應為深紅，產IAA活性為1 000 mg/L，T.gamsii發酵液與Salkowski比色液混合后顯示為紅色，活性為89.46 μg/mL，T.koningiopsis發酵液的顯色反應顏色較淺，活性為6.69 μg/mL，結果表明，兩株菌均具有IAA 分泌能力，其中T.gamsii的產IAA能力較強。

表1 兩株蒜頭果內生木霉的產IAA能力Tab.1 IAA producing ability of two endophytic Trichoderma strains from M.oleifera

2.2.2 蒜頭果內生木霉的解鉀能力T.gamsii和T.koningiopsis接種于解鉀培養基后出現大小不同的透明圈，其中接種T.koningiopsis的透明圈直徑為36.22 mm，較接種T.gamsii（直徑25.91 mm）的透明圈大。經定量檢測，T.koningiopsis和T.gamsii的解鉀活性分別為29.26 mg/L 和11.55 mg/L（表2），由此表明兩株菌均具有解鉀活性，且T.koningiopsis的活性較高。

表2 兩株蒜頭果內生木霉的解鉀能力Tab.2 Potassium dissolving ability of two endophytic Trichoderma strains from M.oleifera

2.3 兩株蒜頭果內生木霉對幼苗的促生作用研究

2.3.1 接種蒜頭果內生木霉對其幼苗的生長性狀的影響 如圖3所示，接種T.gamsii6個月后蒜頭果幼苗的株高增量、葉片增量、莖粗和主根長分別為9.7 cm、6.50 片、1.26 cm 和16.20 cm，較對照增加了162.16%、140.74%、44.83%和37.06%，且與接種T.koningiopsis的處理和對照差異顯著（P＜0.05）。經T.koningiopsis接種處理的幼苗莖粗較對照增加16.09%，且與對照差異顯著（P＜0.05）。結果表明，接種兩株內生木霉均能促進蒜頭果幼苗的生長，其中T.gamsii的促生效果較為顯著。

圖3 接種兩株蒜頭果內生木霉的幼苗株高增量（A）、葉片增量（B）、莖粗（C）和主根長（D）Fig.3 Height increment（A），leaf increment（B），stem diameter（C）and main root length（D）of M.oleifera seedlings inoculated with two strains of endophytic Trichoderma

2.3.2 接種蒜頭果內生木霉對其幼苗吸器數量和最大吸器直徑的影響 如圖4所示，接種T.gamsii的處理組蒜頭果幼苗根部吸器數量最多，為35.60 個，與接種T.koningiopsis的處理組和對照差異顯著（P＜0.05）；接種T.koningiopsis的蒜頭果幼苗根部吸器數量為25.70 個，與對照差異顯著（P＜0.05）。而對照組的蒜頭果幼苗根部吸器最大直徑為1.58cm，顯著高于接種T.gamsii和T.koningiopsis的處理組（P＜0.05），兩組接菌處理的根部吸器最大直徑則無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 接種兩株蒜頭果內生木霉的幼苗根部吸器數量及最大吸器直徑Fig.4 The number of haustoria and the maximum haustorium diameter in the root of M.oleifera seedlings inoculated with two strains of endophytic Trichoderma

2.3.3 接種蒜頭果內生木霉對其幼苗生物量的影響 如表3 所示，接種T.gamsii的地上、地下和全株鮮重以及地上、地下和全株干重分別較對照增加59.71%、33.06%、364.76%、59.47%、33.04%和41.07%，其中地上、全株鮮重以及地上干重與接種T.koningiopsis的處理組和對照差異顯著（P＜0.05），地下鮮重、地下干重以及全株干重與對照差異顯著（P＜0.05）。接種T.koningiopsis的處理全株鮮重顯著高于對照（P＜0.05）。結果表明，接種兩株內生木霉均能一定程度促進蒜頭果幼苗生物量的提高，其中T.gamsii的促進效果更為顯著。

表3 接種兩株蒜頭果內生木霉對蒜頭果幼苗生物量的影響Tab.3 Effect of inoculating two strains of endophytic Trichoderma on the biomass of M.oleifera eedlings

2.3.4 接種蒜頭果內生木霉對其幼苗葉綠素含量的影響 接種T.gamsii的蒜頭果幼苗葉綠素含量最高，為3.37 mg/g，其次是接種T.koningiopsis的處理，二者分別較對照高出21.66%和7.58%（圖5），且均與對照差異顯著（P＜0.05）。由此表明，接種兩種蒜頭內生木霉均能促進幼苗葉綠素含量的升高。

圖5 接種兩株蒜頭果內生木霉的幼苗葉綠素含量Fig.5 The chlorophyll content of M.oleifera seedlings inoculated with two strains of Trichoderma

2.3.5 接種蒜頭果內生木霉對其幼苗抗性相關指標的影響 如圖6 所示，接種T.gamsii的幼苗POD 和SOD 活性最高，分別較對照高出40.85%和28.19%，其中POD 活性與接種T.koningiopsis的處理和對照差異顯著（P＜0.05），SOD活性與對照差異顯著（P＜0.05）。接種T.koningiopsis的處理，其POD 活性較對照高出26.03%且與對照差異顯著（P＜0.05）。由此表明，接種兩種內生木霉能一定程度提高蒜頭果幼苗的抗性水平。

圖6 接種兩株蒜頭果內生木霉的幼苗葉片POD和SOD活性Fig.6 The contents of Pod，SOD activities in leaves of M.oleifera seedlings inoculated with two strains of endophytic Trichoderma

2.3.6 接種蒜頭果內生木霉對幼苗根部定殖率的影響 如圖7所示，其中T.gamsii在蒜頭果幼苗根系的定殖率為58.87%，T.koningiopsis的定殖率為52.16%，表明兩種木霉對蒜頭果幼苗根系有較好的定殖能力。

圖7 兩株蒜頭果內生木霉接種幼苗后在其根系的定殖率Fig.7 The colonization rate of two strains of endophytic Trichoderma in M.oleifera root

2.3.7 接種幼苗不同測定指標的相關性分析 經不同處理的蒜頭果幼苗各項測定指標的相關性分析（表4），莖粗、吸器數量、全株鮮重、葉綠素含量和葉片PDA活性除與最大吸器直徑呈顯著或極顯著負相關外，與其余指標均呈顯著或極顯著正相關。株高增量、葉片SOD含量除與主根長、最大吸器直徑和全株干重無顯著相關性外，與其余指標均呈顯著或極顯著相關。葉片增量除與最大吸器直徑、全株干重外，與其余指標顯著或極顯著正相關。由此表明，不同接種處理的蒜頭果幼苗生長性狀、生物量、葉綠素或抗性相關生理指標間密切相關。

表4 蒜頭果幼苗各指標相關性分析Tab.4 Correlation analysis of various indexes of M.oleifera seedlings

3 討論

本研究中，通過ITS、RPB2和TEF 三片段聯合構建系統發育樹表明，SF151 和SF231 分別與T.gamsii和T.koningiopsis的已知序列位于同一分支，且貝葉斯和最大似然的后驗概率較高；同時，兩株菌的菌落和微觀結構與T.gamsii和T.koningiopsis有關形態學的描述基本一致[25-26]，雖然分生孢子的形態較文獻報道略小，但其長寬比較為接近。通過分子系統學分析和形態學比較可鑒定兩株內生木霉。

木霉的次生代謝產物中含有多種生長激素類物質，通過植物根系吸收能有效促進寄主的生長發育。相關研究表明，野生型擬南芥幼苗接種T.virens和T.atroviride后能促進其生物量增加及側根發育。同時檢測到T.virens能產生吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乙醛和吲哚-3-乙醇3種生長素相關化合物[8]。類似地，You等[27]發現T.koningiopsis也能產生吲哚-3-乙酸。本研究中T.gamsii和T.koningiopsis均具有產IAA 活性，其中T.gamsii產IAA 活性較強，接種蒜頭果后二者均能促進幼苗生長及生物量的增加，其中T.gamsii的促生效果尤為顯著，由此表明供試木霉產IAA 能力對寄主植物的生長發育有重要影響，下一步還有待對其產IAA活性的促生機制進行研究探討。此外，Lilliana等[28]研究表明接種木霉能增加豆科植物的葉面K濃度，另有研究表明噴施木霉可提高大豆對鉀元素20%的吸收[29]。本研究中T.koningiopsis具有較高的解鉀活性，推測對植株鉀元素的吸收有積極的促進作用。

一些木霉種類接種寄主植物后能顯著提高植株的生長性狀和生物量。哈茨木霉T23能有效促進花生分枝、增加結果數、有籽果率及百粒籽重[30]；棘孢木霉M45浸種處理的水稻株高、地上干重以及根際土壤總氮含量顯著上升[31]。本研究中，T.gamsii和T.koningiopsis接種蒜頭果幼苗后對其生長性狀及生物量均有提升，其中T.gamsii能顯著增加植株的株高、葉片數、莖粗、主根長以及鮮重及干重。這與接種T.gamsii顯著促進玉米的生長[32]，接種T.koningiopsis明顯提高馬尾松幼苗的株高、濕重以及根長的研究報道相符[33]。此外，蒜頭果為根部半寄生植物，即使沒有其他寄主植物，根部也會通過吸器產生自寄生現象[34]。本研究中，接種T.gamsii和T.koningiopsis的蒜頭果幼苗根部自吸器數量顯著多于對照，而最大自吸器直徑則顯著小于對照，由此推測自吸器數量多更有利于充分吸收根部的營養物質，這與楊貴釵等的研究報道相符[35]。

葉綠素作為植物生長過程中必不可少的因素之一，不僅可以促進植物的生長，還能提高其抗逆境脅迫能力。本研究中經T.gamsii和T.koningiopsis接種處理的幼苗葉綠素含量顯著高于對照，這與之前木霉促進寄主植物葉綠素含量升高的研究報道相一致[36-37]。而且，木霉能誘導寄主植物的系統抗性，SOD酶通過催化超氧自由基歧化成O2和H2O2，有效抵抗有害物質對植物的傷害[38]。POD 酶除參與植物氧自由基的清除，還與軟木脂及木質素的合成相關[39]。本研究中，T.gamsii和T.koningiopsis接種處理能顯著提高蒜頭果幼苗葉片的POD 及SOD 活性，這與接種深綠木霉和長枝木霉后顯著提高寄主植物抗氧化酶活性的結論相符[15,40]。

此外，研究表明木霉菌具有較強的定殖能力，能有效利用根系里復雜的碳水化合物加快其在根系表面的生長，同時溶解可溶性或微溶性物質，通過螯合或降解作用溶解根系里的金屬氧化物，增加根系對礦質元素的吸收[41]。這與本研究中T.gamsii和T.koningiopsis在蒜頭果幼苗根部的定殖率較高且明顯促進植株生長的結果相一致。相關性分析表明，幼苗的生長形狀、生物量與抗氧化酶活性等指標多呈顯著正相關，由此表明，植物作為協調統一的有機體，各項指標間相互促進、互為影響，綜合反映植株的品質與健康狀況。

4 結論

本研究結合分子系統學和形態學鑒定了兩株蒜頭果內生木霉分別為T.gamsii和T.koningiopsis，同時確定了二者均具有產IAA 能力和解鉀活性。接種試驗表明兩株菌對蒜頭果幼苗生長、生物量增加、葉綠素含量提升及抗氧化酶活性增強有積極的促進作用，其中T.gamsii的促生效果更為顯著，為蒜頭果理想的促生菌。