lncRNA FIRRE靶向miR-490-3p對H2O2誘導的心肌細胞損傷的影響

張雅文,韓偉東,趙 青

1.青島大學附屬醫院電生理科,山東青島 266071;2.山東大學附屬威海市立醫院電生理科,山東威海 264200;3.青島大學附屬醫院平度院區急診科,山東青島266700;4.青島大學附屬醫院心內科,山東青島 266071

在病理狀態下,心肌細胞氧化損傷和細胞凋亡是心血管疾病如心肌梗死、心力衰竭的重要發病機制[1]。以往研究發現,長鏈非編碼RNA(lncRNA)參與調控心肌細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應等過程,可作為心血管疾病的治療靶點[2]。lncRNA FIRRE作為一種lncRNA,參與多種疾病的發展進程。有研究顯示,lncRNA FIRRE在雙側慢性縮窄性損傷小鼠及脂多糖(LPS)誘導小鼠原代小膠質細胞中均表達上調,下調lncRNA FIRRE可抑制LPS誘導小鼠原代小膠質細胞分泌促炎細胞因子,緩解小鼠神經性疼痛[3];lncRNA FIRRE可通過激活NF-κB信號通路促進NLRP3炎癥小體轉錄,從而促進氧糖剝奪/復氧誘導的腦小膠質細胞損傷,可作為缺血性中風的新治療靶點[4]。然而,lncRNA FIRRE對心肌細胞氧化損傷和凋亡的影響還未知。生物信息學預測顯示,lncRNA FIRRE與miR-490-3p有相互結合的位點,miR-490-3p是lncRNA FIRRE的潛在靶基因。研究顯示,miR-490-3p在心肌缺血再灌注損傷中下調,通過上調其表達可減小梗死面積,減輕心肌缺血再灌注損傷[5]?；谝陨涎芯?推測lncRNA FIRRE可能通過靶向調節miR-490-3p參與心肌損傷。因此,本研究采用過氧化氫(H2O2)誘導建立心肌細胞H9c2損傷模型,探討lncRNA FIRRE能否靶向miR-490-3p對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡和氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1材料 H9c2細胞購自武漢普諾賽生命公司,胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技有限公司,DMEM培養液、雙熒光素酶檢測試劑盒、凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技,LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司,RNA抽提試劑盒、PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連寶生物;引物、si-lncRNA FIRRE、si-NC、miR-490-3p、anti-miR-490-3p、anti-miR-NC、miR-NC由上海生工;乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD),活性氧(ROS)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉染和分組 復蘇H9c2細胞,用含10% FBS的DMEM培養液置于CO2培養箱。將對數期H9c2細胞接種至6孔板中,用LipofectamineTM2000脂質體法,轉染si-NC、si-lncRNA FIRRE、miR-NC、miR-490-3p mimics、共轉染si-lncRNA FIRRE與anti-miR-NC、si-lncRNA FIRRE與anti-miR-490-3p。轉染48 h后的細胞均用含200 μmol/L[6]H2O2的培養液處理24 h,依次記為H2O2+si-NC組、H2O2+si-lncRNA FIRRE組、H2O2+miR-NC組、H2O2+miR-490-3p組、H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-NC組、H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-490-3p組。另設置對照組(未轉染的H9c2細胞常規培養液培養24 h)和H2O2組(未轉染的H9c2細胞用含200 μmol/L H2O2的培養液處理24 h)。然后收集細胞用于后續實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測lncRNA FIRRE和miR-490-3p表達 用RNA抽提試劑盒提取各組細胞中總RNA,逆轉錄為cDNA后,行PCR擴增。引物序列:lncRNA FIRRE正向引物為5′-CGTAGGCGCTAGGAAGGCGG-3′,反向引物為5′-CGTGCTAGGAATAGCTCGAGC-3′;miR-490-3p正向引物為5′-CGTGGATCCTTCTTCAACCAA CGGTGGTG-3′,反向引物為5′-CCAGAATTCAAAGCAGGAAGAGTAAGACTTCC-3′。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA FIRRE相對GAPDH、miR-490-3p相對U6的表達量。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 細胞接種至96孔板中(5.0×104個/孔),按照1.2.1設置分組。培養結束,每孔加10 μL CCK-8,孵育2 h,采用酶標儀檢測450 nm處吸光度(A)值。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞接種至6孔板中,按照上述1.2.1設置分組。培養結束收集各組細胞,利用膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒,上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5試劑盒檢測MDA、LDH、ROS水平和SOD活性 細胞接種至6孔板中,按照1.2.1設置分組。培養結束后,收集各組細胞培養上清液,利用LDH、MDA、SOD試劑盒,檢測上清液中LDH、MDA、ROS水平和SOD活性。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗 擴增含miR-490-3p結合位點的lncRNA FIRRE核苷酸序列,構建lncRNA FIRRE野生型(WT-lncRNA FIRRE)熒光素酶報告基因載體;將結合位點突變后,插入pGL3載體,構建lncRNA FIRRE突變型(MUT-lncRNA FIRRE)熒光素酶報告基因載體,此過程由上海生工完成。用LipofectamineTM2000脂質體法,分別共轉染WT-lncRNA FIRRE、MUT-lncRNA FIRRE與miR-NC或miR-490-3p mimic、與miR-NC共轉染細胞,利用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.7免疫印跡法(Western blotting)檢測Cleaved-caspase-3蛋白表達水平 以β-actin為內參,采用免疫印跡法檢測Cleaved-caspase-3的蛋白表達水平,統計蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1沉默lncRNA FIRRE對H2O2誘導的心肌細胞凋亡、增殖和miR-490-3p水平的影響 H2O2組H9c2細胞lncRNA FIRRE相對表達量高于con組,miR-490-3p水平低于con組(P<0.05),H9c2細胞增殖抑制率、凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平均高于con組(P<0.05)。H2O2+si-lncRNA FIRRE組H9c2細胞中lncRNA FIRRE表達量低于H2O2+si-NC組,miR-490-3p水平高于H2O2+si-NC組(P<0.05),H9c2細胞增殖抑制率、凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平均低于H2O2+si-NC組(P<0.05)。H2O2組與H2O2+si-NC組各檢測指標比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

注:A為細胞凋亡檢測;B為凋亡率統計;C為Western blotting蛋白檢測;D為蛋白檢測結果統計;與con組相比,aP<0.05;與H2O2組相比,bP<0.05;與H2O2+si-lncRNA FIRRE組相比,cP<0.05。

表1 沉默lncRNA FIRRE對H2O2誘導的H9c2細胞增殖和miR-490-3p水平的影響

2.2沉默lncRNA FIRRE對H2O2誘導的心肌細胞氧化應激的影響 H2O2組H9c2細胞培養上清液中LDH水平和細胞中MDA、ROS水平均高于con組(P<0.05),細胞中SOD活性低于con組(P<0.05)。H2O2+si-lncRNA FIRRE組H9c2細胞培養上清液中LDH水平和細胞中MDA、ROS水平均低于H2O2+si-NC組(P<0.05),細胞中SOD活性高于H2O2+si-NC組(P<0.05)。見表2。

表2 沉默lncRNA FIRRE對H2O2誘導的H9c2氧化應激的檢測

2.3lncRNA FIRRE靶向調控miR-490-3p表達 DIANA Tool靶基因在線軟件、StarBase數據庫和TargetScan數據庫預測顯示的lncRNA FIRRE與miR-490-3p結合位點,見圖2。與WT-lncRNA FIRRE與miR-NC共轉染組相比,WT-lncRNA FIRRE與miR-490-3p mimics共轉染的H9c2細胞熒光素酶活性降低,差異有統計學意義(t=15.735,P<0.05);與MUT-lncRNA FIRRE與miR-NC共轉染組相比,MUT-lncRNA FIRRE與miR-490-3p mimics共轉染的H9c2細胞熒光素酶活性無明顯變化,差異無統計學意義(t=1.040,P=0.314),見表3。轉染si-lncRNA FIRRE的H9c2細胞中miR-490-3p的表達量(2.89±0.16)顯著高于轉染si-NC的細胞(1.00±0.00),差異有統計學意義(t=35.438,P<0.05)。

圖2 lncRNA FIRRE和miR-490-3p核苷酸的互補序列

表3 lncRNA FIRRE與miR-490-3p的雙熒光素酶檢測結果

2.4過表達miR-490-3p對H2O2誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激的影響 H2O2+miR-490-3p組H9c2細胞中miR-490-3p表達量和SOD活性均高于H2O2+miR-NC組(P<0.05),細胞抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白水平、細胞培養上清液中LDH水平和細胞中MDA、ROS水平均低于H2O2+miR-NC組(P<0.05)。見表4、圖3。

注:A為細胞凋亡檢測;B為凋亡率統計;C為Western blotting蛋白檢測;D為蛋白檢測結果統計;與H2O2+miR-NC組相比,aP<0.05。

表4 過表達miR-490-3p對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡和氧化應激的影響

2.5下調miR-490-3p逆轉沉默lncRNA FIRRE對H2O2誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激的影響 H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-490-3p組H9c2細胞中miR-490-3p表達量和SOD活性均低于H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-NC組(P<0.05),細胞抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白水平、細胞培養上清液中LDH水平和細胞中MDA、ROS水平均高于H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-NC組(P<0.05)。見表5、圖4。

表5 下調miR-490-3p逆轉沉默lncRNA FIRRE對H2O2誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激的影響

注:A為細胞凋亡檢測;B為凋亡率統計;C為Western blotting蛋白檢測;D為蛋白檢測結果統計;與H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-NC組相比,aP<0.05。

3 討 論

心血管疾病嚴重威脅人類生命健康,近年來其發病率逐年升高[7]。心肌細胞損傷如細胞氧化應激、炎癥反應及細胞凋亡是心血管疾病發生發展的重要原因[8],通過探究心肌細胞損傷的分子機制,可為心血管疾病的治療提供分子靶點。lncRNA在真核生物中廣泛存在,其可通過競爭性吸附miRNA調控miRNA靶基因的表達發揮調控作用[9]。報道顯示,TTTY15、FTX和SNHG1等lncRNA與心肌細胞損傷有關[10-12]。lncRNA FIRRE已被報道在多種疾病的發生、發展中發揮作用,如在LPS誘導小膠質細胞中,lncRNA FIRRE水平升高,下調其表達可抑制促炎細胞因子分泌,緩解神經性疼痛[3];在氧糖剝奪/復氧誘導小膠質細胞中,lncRNA FIRRE的高表達可激活NF-κB信號通路,加劇腦小膠質細胞損傷[4]。在本研究中,H2O2處理后,細胞中lncRNA FIRRE表達量升高,通過沉默lncRNA FIRRE表達發現,沉默lncRNA FIRRE降低了H2O2誘導的H9c2增殖抑制率、凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白水平,這說明沉默lncRNA FIRRE對H2O2誘導的H9c2損傷具有保護作用。

H2O2可誘導心肌細胞生成大量ROS,同時降低細胞內SOD等抗氧化酶的活性,導致細胞膜上的脂質發生過氧化,改變細胞膜通透性,進而使細胞結構和功能破壞,誘導細胞凋亡的發生[13]。MDA是細胞脂質過氧化產物之一,其水平高低可反應細胞氧化損傷程度[14]。LDH是一種糖酵解酶,其存在與細胞質中。當細胞膜通透性增加時,LDH被釋放進入細胞外液中,因此,細胞培養上清液中LDH水平可間接反映細胞受損程度[15]。本研究結果顯示,沉默lncRNA FIRRE降低了H2O2誘導的H9c2培養上清液中LDH水平及細胞中MDA,同時提高了SOD的活性,這說明沉默lncRNA FIRRE抑制了H2O2誘導的H9c2氧化損傷。

本研究采用DIANA Tool靶基因在線軟件、StarBase數據庫和Targetscan數據庫對lncRNA FIRRE的靶基因進行了預測,最終得出共同的靶基因miR-490-3p;雙熒光素實驗證實了lncRNA FIRRE可靶向結合并負調控miR-490-3p。研究顯示,動脈粥樣硬化患者血清及氧化低密度脂蛋白刺激的人主動脈血管平滑肌細胞(HA-VSMC)中miR-490-3p的表達下調,上調miR-490-3p可靶向抑制高遷移率族蛋白1抑制HA-VSMC增殖和遷移[16]。在心肌缺血再灌注損傷中,miR-490-3p水平降低,其過表達可減小梗死面積,減輕心肌缺血再灌注損傷[5]。在本研究中,H2O2降低H9c2中miR-490-3p表達,過表達miR-490-3p對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡和氧化損傷具有明顯的抑制作用,提示miR-490-3p可作為減輕心肌細胞損傷的分子靶點。本研究還發現,下調miR-490-3p逆轉了沉默lncRNA FIRRE對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡和氧化損傷的抑制作用,提示沉默lncRNA FIRRE通過靶向上調miR-490-3p的表達來抑制H2O2誘導的H9c2細胞凋亡和氧化損傷。

綜上所述,H2O2促進了心肌細胞H9c2中lncRNA FIRRE的表達,而抑制了miR-490-3p表達;沉默lncRNA FIRRE抑制了H2O2誘導的H9c2細胞凋亡和氧化損傷,作用機制可能與靶向負調控miR-490-3p有關。在未來的研究中將對miR-490-3p的下游靶基因進行探討以進一步完善lncRNA FIRRE的作用機制研究。