三黃漱口液通過調節TLR4-NF-κB通路減輕大鼠牙周炎癥狀

徐俊峰,徐婉君,董艷蓉,鄧祖躍,蔣 霞,袁 穎,方建紅,萬 悅,任艷云

(1.浙江省立同德醫院口腔科,杭州 310012; 2.浙江省食品藥品檢驗研究院,杭州 310052; 3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第903醫院口腔科,杭州 310013)

牙周炎是一種由口腔局部因素引起牙周支持組織的慢性炎癥,主要表現為牙齦紅腫出血和牙槽骨吸收,嚴重時致使牙齒松動、脫落,影響口腔機能[1]。有研究[2]表明,Toll樣受體4(TLR4)參與牙周炎的發生和發展過程,口腔內微生物可激活TLR信號通路,強化炎癥反應。TLR4不僅存在于樹突細胞、單核巨噬細胞、B淋巴細胞等免疫細胞表面,上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞等非免疫細胞也表達TLR4[2]。TLR4的N端結構識別脂多糖(LPS)等病原相關模式分子(PAMP)后,其構象發生變化,進而激活細胞內下游信號通路,最終主要作用是核因子-κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化[3]。NF-κB能調節腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-10(IL-10)等炎癥因子的表達[4]。因為NF-κB通路與炎癥反應和破骨過程的聯系十分緊密,阻斷NF-κB通路可能有助于牙周炎的防止,而抑制TLR4的表達更能有效抑制TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子的上調[5-6]。

三黃漱口液主要成分為黃連、黃芩、黃柏、甘草、金銀花、茜草、烏梅、麥冬和菊花。君藥三黃,即黃芩、黃連和黃柏經常聯用,黃芩偏重于上焦濕熱,黃連偏重于心火、胃火等中焦,黃柏偏重于下焦濕熱,三藥連用可瀉火解毒[7]。臣藥茜草可滋陰涼血;金銀花、菊花清熱解毒;烏梅、麥冬生津;甘草調和諸藥。上藥配合,共成清熱解毒、涼血化瘀止血,生津之劑,對牙周炎的臨床治療效果顯著,能有效減輕疼痛和牙周出血,同時也能達到局部殺菌消炎,清潔口腔的目的,具有良好的臨床應用價值。

本研究旨在探究三黃漱口液治療牙周炎的功效是否與TLR4-NF-κB通路有關,分析該藥的藥理作用機制,為其臨床應用提供實驗數據和理論支持。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

主要試劑:大鼠白介素-8(IL-8)ELISA試劑盒(ELS-2803-2)和大鼠白介素-10(IL-10)ELISA試劑盒(ELS-2871-2)購自合肥博美生物科技有限責任公司; NF-κB抗體(sc-8008)和TLR4抗體(sc-293072)購自美國Santa Curz公司;GAPDH抗體(AF1186)和Bradford蛋白濃度測定試劑盒(P0006)購自上海碧云天生物技術有限公司;Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) HRP(BS13278,購自美國Bioworld公司);制備三黃漱口液所需的中藥飲片由浙江省立同德醫院藥劑科提供。

三黃漱口液的制備:取中藥飲片黃連2 g、黃柏5 g、金銀花5 g、茜草5 g、烏梅5 g、黃芩5 g、菊花5 g、麥冬8 g、甘草3 g,第一道加入1000 mL水,浸泡30 min后,煮沸30 min,第二道加入200 mL水,煮沸30 min,合并2道湯劑,過濾后濃縮至生藥濃度為1.12 g·mL-1的藥液備用。

主要儀器:Spectra Max190酶標儀(美國Molecular Devices公司);AI6000化學發光成像系統(美國GE公司);RM2400型切片機和生物顯微鏡(德國Leica公司);ViiA 7實時定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠,體重180～200 g,清潔級,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。飼養條件:光照12 h·d-1(時間為8∶00～20∶00),自由飲食飲水,溫度20～22 ℃,相對濕度為75%。實驗開始前,進行為期1周的適應性飼養。

1.3 大鼠牙周炎模型的建立

在已有的牙周炎模型建立方法[8]基礎上進行改良。先用2%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠(腹腔注射,0.3 mL·100 g-1),固定好大鼠頭部和軀干后,在上頜左第二和第三磨牙之間插入1個3-0的絲線結扎,結扎第二磨牙,兩端打結固定,同時將大鼠飲用水更換為10%蔗糖水溶液。每天檢查結扎物,以確保它們在實驗期間保持在適當的位置,如有脫落及時進行重新結扎。4周后,可見模型大鼠出現牙齦紅腫出血、牙槽骨吸收及牙齒松動現象。

1.4 動物分組與給藥

將60只大鼠隨機分成對照組、模型組、三黃漱口液低劑量組、三黃漱口液中劑量組、三黃漱口液高劑量組和甲硝唑組,每組10只。除了對照組,其余5組同時進行牙周炎模型建立,模型建立成功后開始給藥。每天2次口腔黏膜涂布給藥,三黃漱口液低劑量、中劑量和高劑量組每天使用的三黃漱口液生藥量分別為4.48、8.96和13.44 g·kg-1,甲硝唑組每天使用0.02 g·kg-1甲硝唑,對照組和模型組使用0.9% NaCl溶液,連續給藥1個月后處死動物,取上頜組織備用。

1.5 HE染色

大鼠上頜骨標本用冰浴的PBS緩沖液漂洗干凈后,置于10%中性甲醛中固定48 h,用乙二酸四乙酸二鈉溶液脫鈣處理1個月,再進行石蠟切片,切片厚度為5 μm。進行常規蘇木精-伊紅(HE)染色,在光學顯微鏡下觀察炎性細胞浸潤及牙槽骨吸收等牙周組織的病理學形態學變化。

1.6 ELISA檢測

切取大鼠牙周炎模型的牙周組織,稱重后加入相應體積的PBS緩沖液,使用勻漿儀充分勻漿,離心后收集上清液。按照ELISA試劑盒提供的說明書進行試驗,檢測各組大鼠牙周組織中促炎因子IL-8和抗炎因子IL-10的水平。

1.7 Western blot檢測

切取大鼠牙周炎模型的牙周組織,稱重后按10 μL·mg-1加入RIPA裂解液,使用勻漿儀充分勻漿,離心后收集上清,用Bradford蛋白濃度試劑盒測定其蛋白濃度。按體積比4：1加入蛋白上樣緩沖液,沸水浴10 min使蛋白變性,制膠進行SDS-PAGE電泳及轉膜。用5%脫脂奶粉對聚偏二氟乙烯(PDVF)膜進行封閉處理1 h,4 ℃下進行一抗孵育過夜。用TBST緩沖液洗膜3次后,進行二抗孵育1 h。TBST緩沖液洗膜2次,TBS緩沖液洗膜1次后,進行顯色處理。以GAPDH為內參,用Image J軟件進行圖片分析。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠牙周炎模型

牙周炎模型建立4周后,對照組和其余5組的牙周組織形態明顯不同:對照組大鼠牙周組織呈粉紅色,質地堅韌,無探診出血,牙槽骨無吸收(圖1A);模型組大鼠牙齦組織呈暗紅色,有明顯的牙槽骨吸收、牙根分叉、探診出血和牙周組織松軟現象,提示炎癥改變( 圖1B)。

A:對照組;B:模型組。黑色箭頭所示為牙周炎組織。圖1 大鼠牙周炎模型

2.2 三黃漱口液改善牙周炎組織病理形態

HE染色結果顯示:對照組牙周組織正常,沒有炎性細胞浸潤(圖2A);模型組牙周組織內有大量炎細胞浸潤,牙槽骨吸收明顯(圖2B);與模型組比較,三黃漱口液各劑量組和甲硝唑組的牙周組織中炎性細胞浸潤減少,成纖維細胞增生增加,低劑量組改變程度不明顯(圖2C),中劑量組有明顯改變(圖2D),高劑量組和甲硝唑組改變最為明顯(圖2E—F)。

A:對照組;B:模型組;C:三黃漱口液低劑量組;D:三黃漱口液中劑量組;E:三黃漱口液高劑量組;F:甲硝唑組。紅色箭頭所示為牙周組織中浸潤的炎性細胞。

2.3 三黃漱口液降低牙周炎性反應

ELISA實驗結果表明,與對照組相比,模型組牙周組織中促炎因子IL-8的水平明顯升高,抗炎癥因子IL-10水平顯著下降(P<0.01)。三黃漱口液各劑量組IL-8水平隨用藥劑量增加逐漸降低,IL-10水平隨用藥劑量增加逐漸升高,三黃漱口液高劑量組的IL-8、IL-10水平與甲硝唑組相近。與模型組相比,三黃漱口液中、高劑量組和甲硝唑組的IL-8水平顯著降低,IL-10水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 三黃漱口液影響牙周IL-8和IL-10水平

2.4 三黃漱口液影響TLR4-NF-κB通路相關蛋白表達

與對照組相比,模型組的TLR4和NF-κB的表達明顯升高(P<0.01);與模型組比較,三黃漱口液各劑量組的TLR4和NF-κB的表達均降低(P<0.05或P<0.01);與三黃漱口液低劑量組比較,三黃漱口液中劑量組和三黃漱口液高劑量組TLR4和NF-κB的表達進一步降低(P<0.01)。見圖3。

*與對照組比較P<0.01;#與模型組比較P<0.05;##與模型組比較P<0.01;△P<0.01與三黃漱口液低劑量組比較。

3 討論

牙周炎是一種世界性常見疾病,其全球年齡標準化患病率為11.2%[8]。同時,口腔病灶中的微生物及其代謝產物可進入身體其他組織器官,誘發多種疾病,如糖尿病、早產及低體重兒、心血管疾病、風濕性關節炎等[9]。

本次實驗結果表明,給予三黃漱口液的牙周炎大鼠牙周組織與模型組相比,形態學發生了明顯改變,主要表現為牙周組織的炎性浸潤明顯減少,成纖維細胞增生活躍,初步驗證了三黃漱口液對牙周炎的治療作用。文獻[6]提到,牙周炎是一種由福賽擬桿菌、伴放線聚集桿菌和牙齦卟啉單胞菌等革蘭氏陰性厭氧菌感染引起的慢性炎癥性疾病,LPS是牙周炎病原菌的重要致病因素。TLR4是模式識別受體家族的關鍵受體之一,是LPS的主要受體,與牙周炎癥的發生發展密切相關[10]。有研究[11]顯示,LPS處理過的人牙周膜細胞(human periodontal ligament cell,hPDLC)中TLR4的表達顯著上升,且有研究者[12-13]發現牙周炎病人的唾液和血漿中的TLR4表達明顯提高。本實驗結果表明,牙周炎模型組TLR4的蛋白表達明顯升高,與對照組相比一致。TLR4通路的激活可以增強NF-κB的活性,從而促進炎癥因子的生成[14-15]。NF-κB是一種公認的轉錄因子,可以調節炎癥細胞因子的產生,包括TNF-α、IL-1、IL-8和IL-10等[16]。同時有研究者報道,TLR4表達的增加與NF-κB的激活相關,以響應TLR4配體,導致促炎細胞因子水平升高[17]。在hPDLC炎癥反應實驗中,LPS誘導后,miR-146a 通過抑制 TLR4 信號途徑抑制炎癥反應,并降低炎性細胞因子 NF-κB 的表達[18]。本研究發現,與對照組相比,牙周炎模型組NF-kB蛋白表達明顯升高,促炎因子IL-8的水平明顯升高,同時抗炎因子IL-10的水平明顯降低。三黃漱口液給藥后,牙周炎大鼠的牙周組織中TLR4、NF-κB蛋白表達和促炎因子IL-8的水平均降低,而抗炎因子IL-10的水平有所升高,這表明三黃漱口液可能通過調節TLR4-NF-κB通路發揮對牙周炎的治療作用。

綜上所述,本研究結果證明三黃漱口液對牙周炎具有一定的治療作用,其作用機制可能包括降低TLR4水平,調節TLR4-NF-κB通路,促進抗炎因子IL-10的生成和抑制促炎因子IL-8的生成。