不同品種大球蓋菇原生質體單核化及單核體的特性

周 峰,楊煥玲,2*,趙 妍,姜淑霞,陳明杰,李正鵬,2,查 磊,2,李 玉**

(1 上海市農業科學院食用菌研究所,上海 201403;2 上海國森生物科技有限公司,上海 201403;3 山東農業大學植物保護學院,泰安 271018)

大球蓋菇(Stropharia rugosoannulata)又名皺環球蓋菇、酒紅色球蓋菇、赤松茸[1-2],不僅含有豐富的營養物質,味道鮮美,深受消費者喜愛[3],而且在實現“鄉村振興”戰略中同樣發揮重要作用,可以提高農田利用率、增加經濟效益、改善土壤品質等[4]。 大球蓋菇作為新興發展產業面臨很多亟待解決的問題,如高溫環境下燒菌、易開傘,育種周期長,野生資源少,種質資源匱乏等。 為滿足市場需求,豐富大球蓋菇的種質資源庫,定向育種迫在眉睫。 相較于傳統常規的食用菌育種方法,原生質體技術開辟了食用菌育種的新天地,單核原生質體具有相對穩定而集中的親本性狀,可以減少篩選雜交后代的工作量,同時不受栽培季節限制,有效地縮短了育種周期[5]。 目前原生質體技術在食用菌育種方面也廣泛應用。 高明俠等[6]將紫芝和赤芝原生質體使用電融合方法獲得高多糖的靈芝。 王淑珍等[7]利用靈芝與糙皮側耳的原生質體融合,選育木栓質化較弱的靈芝新菌株。 燕曉翠等[8]通過電融合糙皮側耳和釀酒酵母原生質體的方法,獲得了生長較快且有效降解木質素的新菌株。 鄭錦榮[9]采用原生質體融合技術獲得3 株金針菇與巨大口蘑融合的新菌株。 蔡佺佑[10]采用原生質體融合育種方法,以秀珍菇和巨大口蘑為親本菌株選育出2 株新菌株。 原生質體融合的方法也應用于大球蓋菇育種[11]。 朱靜嫻[12]利用原生質體育種技術馴化出3 株大球蓋菇耐高溫菌株。 任紀帆等[13]通過原生質體融合和單孢雜交選育出‘山農球蓋3 號’耐高溫高產菌株。 單核原生質體特殊的遺傳背景,在理論上是研究其基因定位和遺傳性狀的重要材料,在育種上是形成以單核原生質體為材料的新方向,具有廣闊的應用和推廣前景[14-16]。

原生質體單核化的關鍵是原生質體的制備及再生,影響原生質體制備的因素有很多,主要包括酶的種類及濃度、反應溫度、酶解時間、滲透壓穩定劑種類及濃度等,不同的食用菌有其特定的最佳條件。 研究表明,真姬菇、褐色雙孢蘑菇、蛹蟲草、桑黃、草菇等食用菌原生質體制備的條件各不相同[17]。 本試驗通過不同品種大球蓋菇原生質體單核化,獲得單核體,探究單核體菌絲形態特征,為利用原生質體技術選育新品種做鋪墊,同時為大球蓋菇的遺傳和育種工作提供不同品種的單核體材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

本研究所用供試菌株及其來源見表1。

表1 供試菌株及其來源Table 1 Tested strains and their sources

1.1.2 主要儀器

智能食用菌培養箱(型號:ZJX-300A),杭州錢江儀器設備有限公司;潔凈工作臺(型號:VS-1300LU),蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;均質儀(型號:32BL80,產地:美國);超級恒溫槽,上海比郎儀器有限公司;倒置顯微鏡(產地:菲律賓);電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司。

其他試材:血球計數板,無紡布,普通漏斗,0.20 μm 細菌過濾器,砂芯漏斗,50 mL 離心管,20 mL 離心管。

1.1.3 主要試劑

溶壁酶購自廣東省微生物研究所;甘露醇購自生工生物工程上海股份有限公司;PDA 粉(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)、PDB 粉(馬鈴薯葡萄糖肉湯)購自美國碧迪醫療器械(上海)有限公司。

1.1.4 培養基類型

固體培養基(加富PDA 培養基):PDA 粉39 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,胰蛋白胨2 g,酵母粉2 g,水1 L。 液體培養基:PDB 粉24 g,胰蛋白胨2 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,VB10.1 g,水1 L。再生培養基:PDA 粉39 g,胰蛋白胨2 g,酵母粉2 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,K2HPO41.5 g,KH2PO41.5 g,VB10.1 g,VB60.1 g,甘露醇109 g,水1 L。 鏡檢培養基:PDA 粉0.39 g,吐溫-20 20 μL,水100 mL。 以上培養基均在121 ℃高壓滅菌15 min 后冷卻備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 固體菌絲的制備

在無菌超凈工作臺中,將4 ℃冰箱保存的大球蓋菇菌種25 ℃活化2 d 后,取3—5 mm 大小的菌絲塊接種到固體培養基上,于25 ℃恒溫黑暗條件下培養14 d,備用。

1.2.2 液體菌絲的制備

將長勢良好的菌落轉至均質儀,并加入50 mL 液體培養基打碎,分別接種于盛有50 mL 液體培養基的250 mL 三角瓶中,25 ℃恒溫培養箱黑暗靜置培養3 d,備用。

1.2.3 滲穩劑的制備

甘露醇穩滲液:稱取10.9 g 甘露醇溶解于100 mL 蒸餾水中,配成0.6 mol∕L 的甘露醇穩滲液,121 ℃高壓滅菌15 min 后備用。

1.2.4 酶液的制備

稱取0.12 g 溶壁酶溶于8 mL 0.6 mol∕L 滲透壓穩定劑,使酶液含量為1.5%,經0.20 μm 細菌過濾膜過濾除菌后備用。

1.2.5 原生質體的制備

收集并過濾液體培養3 d 的菌絲,無菌水沖洗后用無菌吸水紙吸干多余水分,將菌絲轉移至酶液含量為1.5%的液體中,輕微振蕩使菌絲均勻分散開,置于30 ℃水浴鍋中酶解3 h,每隔1 h 輕微震蕩,使其與酶液充分接觸。 用G-2 砂芯漏斗過濾除去酶解液中殘留的菌絲,將收集的濾液放在50 mL 離心管中,4 ℃、4 000 r∕min 離心15 min,棄上清,沉淀用0.6 mol∕L 的甘露醇洗滌2 次,即得到純化的原生質體。

1.2.6 原生質體再生

將原生質體用0.6 mol∕L 的甘露醇稀釋至適當濃度,用血球計數板計數原生質體總數。 吸取100 μL稀釋好的原生質體懸液于再生培養基上,用涂布棒涂布均勻。 同時用無菌水脹破原生質體后,以同樣方法涂布于再生培養基上,以消除非原生質體所形成的菌落帶來的誤差。 25 ℃恒溫黑暗條件下倒置培養3—5 d 可見再生菌落,并統計原生質體再生菌落數。 計算各個品種原生質體的再生率:

原生質體再生率=[(原生質體再生菌落數-對照組再生菌落)∕原生質體總數] ×100% (1)

1.2.7 原生質體單核化

將原生質體再生的單個菌落(長出如針尖大小時挑出)接種在鏡檢培養基上,統計單個菌落總數。25 ℃培養3—5 d 后使用顯微鏡觀察鎖狀聯合情況,若無鎖狀聯合則為單核體,并統計單核化率。

1.2.8 菌絲形態特征

將不同品種的大球蓋菇菌株及其單核體接種于鏡檢培養基上,置于25 ℃恒溫培養箱中黑暗培養7 d,觀察菌落大小、長勢、顏色等特征,分析出發菌株與單核體菌落形態的差異性。 每個試驗設置4 個重復。

2 結果與分析

2.1 不同大球蓋菇品種的原生質體再生率

將制備的原生質體用0.6 mol∕L 的甘露醇洗滌后得到純凈的原生質體,如圖1 中黑色圓圈標出的即為原生質體。

圖1 顯微鏡下的大球蓋菇原生質體(20 ×)Fig.1 Protoplasts of Stropharia rugosoannulata under microscope(20 ×)

由表2 可知,‘土肥’品種原生質體再生能力最強,3 d就已經長滿培養皿,并且菌絲濃白,氣生菌絲發達,再生率最高,達1.37%;‘高郵’和‘大T’品種再生菌落均4 d 長滿培養皿,‘高郵’菌絲較稀疏且分散,再生率為1.13%,菌落由白色濃密菌絲組成;‘大T’菌絲蔓延擴展,呈擴散狀,菌落較大,菌絲先由透明變為白色,在試驗的3 個品種中再生率最低,為0.90%。

表2 不同品種大球蓋菇原生質體再生率Table 2 Regeneration rate of protoplasts of different strains of Stropharia rugosoannulata

2.2 不同品種大球蓋菇的原生質體單核化率

從表3 可以看出,供試驗的3 個大球蓋菇品種的單核化率‘大T’品種的最高,達到85.2%,‘土肥’的單核化率次之,為66.0%,‘高郵’的單核化率最低為59.8%。 單個菌落接種在鏡檢培養基上,可能由于培養基較薄,營養物質不夠充足,生長的菌絲較細,在倒置顯微鏡下難以觀察鎖狀聯合,待菌絲生長5 d 后才能清晰觀察到有無鎖狀聯合。

表3 不同品種大球蓋菇原生質體單核化率Table 3 Monokaryotization rate of protoplasts of different strains of Stropharia rugosoannulata

2.3 不同品種大球蓋菇的單、雙核體菌落特性

觀察菌落大小、長勢、顏色、形態等特征,統計不同品種大球蓋菇單、雙核菌絲體菌落形態的特性。 如圖2 及表4,大球蓋菇的不同品種菌落形態差別明顯,而同一品種的單核體和雙核體在菌落形態上差別較小。 使用鏡檢培養基,提高了培養基的透明度,觀察更為清晰明顯,但生長速度較普通PDA 培養基慢?！练省贩N菌絲生長非常稀疏,菌落顏色為白色,有同心輪紋,微凸起,邊緣整齊,單核和雙核體的菌落形態略微有差別,雙核體的菌落邊緣有氣生菌絲生長,但單核體邊緣菌絲匍匐,生長不旺盛,多為基內菌絲。 ‘大T’品種菌絲生長旺盛,濃密,長勢良好,邊緣整齊,菌落呈放射狀,圓形,平坦,單雙核無明顯差異?！哙]’品種單雙核菌絲體差異較大:單核體菌落呈放射狀,平坦,基內菌絲多,氣生菌絲較少,菌絲稀疏;雙核體菌絲生長旺盛,菌落白色,邊緣不整齊,呈絨氈狀,氣生菌絲發達,菌絲濃密。

圖2 不同品種大球蓋菇的菌落形態Fig.2 Colony morphology of different strains of Stropharia rugosoannulata

表4 不同品種大球蓋菇的菌落特性Table 4 Colony characteristics of different strains of Stropharia rugosoannulata

3 討論與結論

大球蓋菇在溫度較高的環境下原基難分化、菌蓋易開傘,品質和產量均急劇下降[12],為解決大球蓋菇發展的瓶頸,可通過快速定向育種的途徑豐富大球蓋菇種質資源,單核原生質體成為探究遺傳背景及開展原生質體技術育種的重要前提。

原生質體再生率的高低是原生質體技術應用的關鍵。 本研究采用0.6 mol∕L 的甘露醇做滲透壓穩定劑,制備菌齡3 d 的菌絲和含量為1.5%的酶液,在30 ℃恒溫水浴鍋中酶解3 h,濾液在4 ℃、4 000 r∕min條件下離心15 min,再生培養基在普通的PDA 培養基的基礎上加入VB1、VB6,以促進進原生質體再生。鄒彰毅等[18]在再生培養基中添加纖維二糖和VB1,提高了姬松茸原生質體的再生率,此結果在本試驗中再次得到驗證。 大球蓋菇中供試驗的3 個不同品種再生率均較高,‘土肥’品種再生率最高,達1.37%,‘高郵’品種再生率次之為1.13%,‘大T’品種的再生率最低為0.90%。 許梅[19]用雙層平板法得到大球蓋菇再生率為0.96%,遠低于‘土肥’和‘高郵’兩個品種,進一步說明大球蓋菇的再生率與不同品種相關,本試驗原生質體再生的配方為最佳條件。 茶樹菇再生菌落中異核體與單核體存在時間差,8—10 d 異核體菌落先生成,10 d 之后產生單核體菌落[20]。 但是,本試驗表明大球蓋菇原生質體再生速度較快,原生質體單核化率高,且單核體和雙核體再生的菌落幾乎同時形成,這與閆培生等[11]和Yan 等[21]的結果相符。

原生質體單核化是快速獲得單核體雜交親本的有效手段,已從許多食用菌中通過單核化獲得單核體。 本研究獲得了不同品種大球蓋菇的原生質體單核體,供試驗的三個大球蓋菇品種的單核化率‘大T’品種高達85.2%;‘土肥’品種單核化率次之,為66.0%;‘高郵’品種單核化率最低,為59.8%。 ‘大T’品種單核化率是已報道過的食用菌中單核化率最高的,這也豐富了食用菌原生質體單核化和遺傳育種研究的內容。 ‘土肥’和‘高郵’品種的單核體與雙核體在菌落形態及生長速度上有所差別,‘土肥’品種菌絲生長局限,非常稀疏,菌落顏色為白色,有同心輪紋,微凸起,邊緣整齊,單核和雙核體的菌落形態略微有差別,雙核體的菌落邊緣有氣生菌絲生長,但單核體邊緣菌絲匍匐,生長不旺盛,多為基內菌絲。 ‘高郵’品種菌絲蔓延生長,邊緣不整齊,菌落白色,培養皿上單雙核菌絲體差異較大,單核體菌落呈放射狀,平坦,基內菌絲多,氣生菌絲較少,菌絲稀疏,雙核體菌落呈絨氈狀,氣生菌絲發達,菌絲濃密。 目前,已使用本試驗選育的原生質體單核體進行了高溫菌種的選育,并獲得高溫大球蓋菇品種[12]。

將不同品種大球蓋菇原生質體單核化可獲得遺傳背景單一的單核體,初步探究單核體的菌落特性,后續對其進行分類確定交配型,不僅可為構建大球蓋菇遺傳體系提供原材料,同時還可為定向育種提供更多材料,進一步豐富大球蓋菇種質資源。