吳華莉,張鶯鶯,黃 濟,王洪洋,曹建國,涂尾龍,范 春,談永松*
(1 上海市農業科學院畜牧獸醫研究所,上海 201106;2 上海種豬工程技術研究中心,上海 201302;3 上海實驗動物研究中心,上海 201302)
生長因子受體結合蛋白7(Growth factor receptor-bound protein7,GRB7)是重要的信號銜接蛋白,介導來自FAK 和EphB1 受體的信號通路,在細胞腫瘤遷移、增殖等過程中發揮重要作用[1-3]。 GRB7 蛋白含535 個氨基酸殘基,結構上有3 個保守區域,分別為富含脯氨酸的N 末端、GM 結構域和C 末端SH2 結構域。 GRB7 與GRB10、GRB14 序列同源性較高,共同構成GRB7∕10∕14 家族蛋白,其主要是通過C 端的SH2結構域識別胞膜酪氨酸激酶受體,參與級聯酶促反應[4]。 人的GRB7 基因位于17q21[5]。 豬GRB7 基因定位于12 號染色體,包含15 個外顯子,長度為2 191 個核苷酸[6]。 楊金娥[7]研究發現豬GRB7 存在兩個突變位點(理論上可產生9 個合并基因型),突變位點對應基因片段的163 bp 和243 bp 處。 楊述林等[8]研究發現,豬GRB7 基因163 位點和243 位點與背膘厚顯著相關(P<0.05)。 本試驗通過檢測GRB7 基因163 突變位點和243 突變位點在上海地區5 個豬群體中的多態分布,旨在為豬遺傳育種研究提供參考。
于上海祥欣畜禽有限公司采集92 個杜洛克豬、148 個大白豬和69 個長白豬豬耳組織塊,于上海豬狀元畜牧綜合場采集79 個梅山豬豬耳組織塊,于上海富民農場采集74 個申農豬豬耳組織塊,共計462 個樣品。 將其放入預先加入1.0 mL 75%酒精的1.5 mL 離心管內,儲存在冰盒里運回實驗室,置于-20 ℃冰箱保存備用。
組織DNA 提取試劑盒采購于上海軒略科技發展有限公司,PCR 引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成,2 ×Taq PCR Master Mix 和DL 2000 DNA Marker 采購于寶生物工程(大連)有限公司;BstUⅠ內切酶采購于上海朝瑞生物科技有限公司。
1.2.1 DNA 提取
利用AXYGEN 組織DNA 提取試劑盒提取基因組DNA,并將其統一稀釋至50.0 ng∕mL,分裝后將樣品保存在-80 ℃冰箱內備用。
1.2.2 PCR 擴增
PCR 反應體系為20 μL:DNA 模板1.0 μL,2 ×Taq PCR Master Mix 11.0 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,RNase-Free ddH2O 補至20 μL。 擴增上游引物序列為5’-GTCTCATCTCAGCAGCTCC-3’,下游引物序列為5’-GAGCATCTCGCACACGTAG-3’[7]。 反應條件為:94 ℃5 min;94 ℃30 s,63 ℃30 s,72 ℃30 s,32 個循環;72 ℃10 min。 利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物。
1.2.3 基因型檢測
選擇只有一條目的條帶的樣品PCR 產物,進行限制性內切酶試驗。 反應體系為:PCR 產物4.0 μL,10 ×Buffer 2.0 μL,BstUⅠ內切酶0.5 μL,ddH2O 9.5 μL,總體積為16.0 μL。 反應溫度37 ℃,時間2 h,利用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因型。
PCR 擴增序列片段存在兩處T∕C 多態,分別位于GRB7 基因第2 內含子和第3 外顯子[7]。 理論上PCR 擴增產物經過BstUⅠ酶切后可產生9 種基因型[7](表1)。
表1 GRB7 基因酶切后的基因型Table 1 Genotypes of GRB7 gene after enzyme digestion
根據參考文獻[9]中方法計算GRB7 基因163 位點和243 位點突變在5 個豬群體內的基因型頻率、等位基因頻率以及合并基因型頻率。 采用GENEPOP 3.1 軟件計算基因雜合度(Heterozygosity,He)、純合度(Homozygosity,Ho)、有效等位基因數(Effective number of alleles,Ne)和多態信息含量(Polymorphism information content,PIC)。
由圖1 可知,以各樣本DNA 為模板,PCR 產物經電泳檢測后,獲得的目的條帶均為626 bp。 該片段包含2 個突變位點,可用于后續的酶切試驗。
圖1 GRB7 基因PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 PCR products of agarose gel electrophoresis of GRB7 gene
豬GRB7 基因163 位點和243 位點經過內切酶BstUⅠ消化后,檢測出6 種合并基因型(圖2,圖3):(1)CCTT 型:463 bp、163 bp; (2) CCTC 型: 463 bp、 383 bp、 163 bp、83 bp;(3)CCCC 型:383 bp、163 bp、83 bp;(4)CTTT 型:626 bp、463 bp、163 bp;(5)CTCT 型:626 bp、383 bp、163 bp、83 bp;(6)TTTT 型:626 bp。
圖2 豬GRB7 基因PCR-RFLP 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 PCR-RFLP result of agarose gel electrophoresis of GRB7 gene
圖3 豬GRB7 基因PCR-RFLP 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 PCR-RFLP result of agarose gel electrophoresis of GRB7 gene
由表2 所示,163 位點在杜洛克豬群體內CC 基因型為優勢基因型,只有1 個樣品為TT 基因型,無CT基因型;在長白豬和大白豬群體內CC 基因型和CT 基因型呈中態分布,只有少量TT 基因型;在申農豬群體內CC 基因型少于CT 基因型和TT 基因型;在梅山豬群體內TT 基因型最多,CT 基因型較少,未檢測出CC 基因型。 在等位基因頻率方面,163 位點在梅山豬群體內T 等位基因比例較高,在杜洛克豬、長白豬和大白豬群體內C 等位基因比例高,在申農豬群體內C 和T 等位基因呈現均勻分布。 163 位點突變PIC 值在長白豬、大白豬和申農豬群體內為0.25—0.50,表現為中度多態,在杜洛克和梅山豬群體內的PIC 值低于0.25,表現為低度多態。
表2 GRB7 基因在5 個豬群體內的基因型頻率、等位基因頻率及群體遺傳結構Table 2 Genotype and gene frequency and population genetic structure indices of GRB7 gene in five pig populations
243 位點在杜洛克豬群體內CT 基因型最多,其次為CC 基因型,只有少量TT 基因型;在長白豬群體內CT 基因型最多,TT 基因型略少,CC 基因型最少;在大白豬群體內CC 基因型和CT 基因型呈中態分布,TT 基因型最少;在申農豬群體內TT 基因型最多,CT 基因型略少,CC 基因型最少;在梅山豬群體內TT 基因型最多,CT 基因型很少,無CC 基因型。 243 位點在梅山豬和申農豬群體內T 等位基因比例較高,在長白豬群體內T 等位基因為優勢等位基因,在杜洛克豬和大白豬群體內C 等位基因為優勢等位基因。 243位點突變PIC 值在杜洛克豬、長白豬和大白豬群體內為0.25—0.50,表現為中度多態,在申農豬和梅山豬群體內的PIC 值低于0.25,表現為低度多態。
如表3 所示,在杜洛克豬群體內GRB7 基因163 位點和243 位點突變合并基因型有4 種,其中CCTC型為優勢基因型,CCTT 型和CTCT 型頻率較低;在長白豬群體內有6 種,其中CCTC 型為優勢基因型,CCTT 型和TTTT 型頻率較低;在大白豬群體內有6 種,其中CTCT 型為優勢基因型,CCTT 型和CCTC 型頻率最低;在申農豬群體內有6 種,其中TTTT 型為優勢基因型,CCTC 型和CCCC 型頻率較低;在梅山豬群體內有3 種,其中TTTT 型為優勢基因型,CTTT 型和CTCT 型頻率較低。
表3 GRB7 基因163 位點和243 位點突變合并基因型頻率Table 3 The frequency distribution of GRB7 combined genotype
GRB7 基因作為信號聯結蛋白,參與細胞增殖和腫瘤轉移過程,在乳腺癌、食管癌和胃腸道間質瘤組織中高度表達,可以作為癌癥預后標志物[10-13]。 有研究表明,小鼠和綿羊GRB7 基因在動物早期胚胎附植過程中發揮作用[14-15]。 楊金娥[7]研究發現,豬GRB7 基因163 位點和243 位點突變的CC 基因型個體的紅細胞數目比TC 基因型個體的紅細胞數目多。
合并基因型的效應不是單個基因型效應的簡單相加,群體的遺傳改良還受合并基因型頻率影響[16]。本試驗發現,GRB7 基因163 位點和243 位點突變所產生的優勢基因型、等位基因頻率和合并基因型及頻率在5 個不同豬群體內不一樣。GRB7 基因TTTT 合并基因型在申農豬和梅山豬群體內為優勢基因型,在杜洛克豬和長白豬群體內CCTC 合并基因型頻率較高,在大白豬群體內CTCT 合并基因型頻率較高。 申農豬是長白豬×(大白豬×二花臉豬)為基礎群構建的母本新品系,含有中國地方豬種二花臉豬血統,二花臉豬和梅山豬都屬于太湖豬,是仔數高產品種,但申農豬和梅山豬的背膘厚比外來品種杜洛克、長白豬和大白豬高[17-22],可能與豬GRB7 基因163 位點和243 位點突變有關[8]。 下一步將檢測TTTT 合并基因型與申農豬和梅山豬的背膘厚的關系。