靈芝破壁孢子粉中粗多糖含量測定的不確定度評估及控制

黃柳娟,王紅梅,邵 毅

(上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所,上海 201403)

靈芝(Ganoderma lucidum)是多孔菌科真菌赤芝的干燥子實體,在我國具有悠久的藥用歷史[1],2018年產量達16.77 萬t[2]。 孢子粉是靈芝的生殖細胞,其功能活性物質含量顯著高于靈芝子實體[3],是深受消費者青睞的功能食品。 靈芝多糖具有抗腫瘤、增強免疫力等生物活性,是靈芝的主要活性成分之一[4-5],且不同破壁方法處理后,孢子粉粗多糖抗氧化活性與多糖質量濃度呈一定效量關系[6]。 因此不論是評價靈芝破壁孢子粉產品的品質質量,還是精準評價孢子粉粗多糖的營養功效,都需要對其進行準確測量。

目前,食品和農產品中粗多糖的檢測還沒有國家標準方法,食用菌行業一般采用《NY∕T 1676—2008食用菌中粗多糖的測定》中規定的苯酚-硫酸比色法進行測定[7]。 測量不確定度用以表征合理的賦予被測量值的分散性,以此來判斷測定值的可靠程度[8]。 通過不確定度評定,可以分析出對測量結果產生影響的關鍵因素。 有研究表明,分光光度法測定粗多糖的過程中,標準曲線的擬合對總不確定度影響最大,其次為重復性測定和分光光度計引入的不確定度[9-13],但關于標準品(葡萄糖)在配制稀釋過程中引入的不確定度等因素未被涉及。 本研究根據國家計量技術規范《JJF 1059.1—2012 測量不確定度評定與表示》[14],針對標準NY∕T 1676—2008,對檢測過程中引入的不確定度分量進行全面分析,從而為粗多糖檢測分析方法的改進和檢測質量的控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

靈芝(Ganoderma lucidum)破壁孢子粉。

1.2 試劑與儀器設備

葡萄糖(分析純,美國Sigma 公司);苯酚[分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司];濃硫酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);無水乙醇(分析純,上海泰坦科技股份有限公司)。

UV-5100B 紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);AL204-IC 電子分析天平(德國Mettler Toledo 公司);100—1 000 μL 單道可變量程移液器(德國Eppendorf 公司);Sorvall ST16R 離心機(美國Thermo 公司);1 000 mL 容量瓶和250 mL 單標線容量瓶(A 級,上海申玻儀器公司)。

1.3 粗多糖含量測定方法

依據《NY∕T 1676—2008 食用菌中粗多糖含量的測定》[7]對靈芝破壁孢子粉中的粗多糖進行測定。

1.4 不確定度計算

1.4.1 不確定度來源分析

根據檢測方法全過程,分析可能影響檢測結果的各操作步驟及相關設備。

1.4.2 不確定度分量計算

電子分析天平、移液器和紫外-可見分光光度計等設備的標準不確定度u(x)按其檢定證書標示的擴展不確定度U和包含因子k來計算,公式為;相對不確定度為標準不確定度與該儀器測量數值的比值[14]。

基準物質(標準品)和實驗室環境溫度影響溶液體積的標準不確定度為被測量可能值區間的半寬度a和包含因子k的比值,公式為,包含因子k采用矩形分布,定值為[14]。

標準曲線擬合引入的不確定度采用線性最小二乘法來評估[16]。

測定方法重復性引入的不確定度由貝塞爾公式來評估[14]。

1.4.3 合成不確定度及分量不確定度貢獻排序

用方和根方法計算合成不確定度,并根據各個不確定度分量的數值大小對合成不確定度的貢獻進行排序。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據NY∕T 1676—2008 中方法[7],粗多糖含量計算的數學模型:

公式(1)中,ω:樣品中粗多糖的含量,%;m1:從標準曲線中獲得的樣品溶液中粗多糖的質量,μg;V1:樣品定容體積,mL;V2:吸取樣品試樣溶液的體積,mL;m2:樣品質量,g;0.9:葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數。

靈芝破壁孢子粉的粗多糖含量測定過程中不確定度來源包括:(1)葡萄糖標準溶液配置和稀釋過程中引入的不確定度;(2)供試品處理過程中引入的不確定度;(3)標準曲線擬合引入的不確定度;(4)樣品間的重復性引入的不確定度;(5)紫外-可見分光光度計的精度引入的不確定度(圖1)。

圖1 不確定度來源因果圖Fig.1 Causality diagram of uncertainty source

2.2 葡萄糖標準溶液引入的不確定度

標準溶液引入的不確定度主要包括葡萄糖標準品純度P,質量M0,葡萄糖標準溶液的定容體積V0和稀釋過程,以及實驗室環境溫度對水體體積的影響T。

2.2.1 標準品純度引入的不確定度

試驗使用的葡萄糖標準品純度為99.5%±0.5%,按矩形分布計算(k=),則其標準不確定度為,其相對不確定度為。

2.2.2 標準品稱量引入的不確定度

根據粗多糖檢測方法,稱取100 mg 105 ℃烘干至恒重的葡萄糖,則標準品稱量引入的不確定度即電子天平精密度引入的不確定度。 電子天平校準證書顯示其擴展不確定度U=0.3 mg(k=2),則標準不確定度為,其相對不確定度為-4。

2.2.3 標準品溶液定容引入的不確定度

粗多糖檢測標準規定:葡萄糖稱重后,用1 000 mL 容量瓶定容。 由JJG 196—2006[15]查得,該規格的容量瓶的容量允差為±0.40 mL,按三角分布(k=)計算其標準不確定度為u(V0) ==1.633 ×10-1,其相對標準不確定度為。

2.2.4 標準曲線梯度稀釋時移液器引入的不確定度

葡萄糖標準曲線繪制時,要求分別吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL 的標準葡萄糖溶液至玻璃試管中,用蒸餾水補至1.0 mL。 試驗使用標稱容量為100—1 000 μL 的移液器進行移液操作。 移液器校準證書顯示其擴展不確定度U= 2.8 μL(k= 2),則其標準不確定度為u(V2)=。 移取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL 的葡萄糖標準溶液或水時,相對標準不確定度分別為:

標準曲線梯度稀釋時移液器引入的不確定度為:

2.2.5 環境溫度變化引入的不確定度

試驗環境溫度控制在20 ±2 ℃,此時水的膨脹系數為2.1 ×10-4,按矩形分布(k=)計算其標準不-4確定速度為。

2.2.6 標準溶液引入的不確定度合成

將影響標準溶液的各個不確定度分量進行合成,得到標準溶液引入的不確定度urel1。

2.3 供試品引入的不確定度

供試品引入的不確定度主要包括供試品質量M2,供試品溶液的定容V1和移取過程,以及試驗環境溫度對水體體積的影響等。

2.3.1 供試品稱量引入的不確定度

同2.2.2,電子天平的標準不確定度為u(M)=1.500×10-4。 根據標準方法,稱取0.500 0 g 靈芝破壁孢子粉作為待測樣品,重復稱取10 次,平均質量M2為0.500 4 g,則其相對不確定度為urel(M2)=。

2.3.2 供試品溶液定容引入的不確定度

樣品前處理后,將待測液全部轉移至250 mL 容量瓶中。 A 等品250 mL 容量瓶的容量允差為±0.15 mL[15],按三角分布(k=)計算其標準不確定度為,其相對標準不確定度為:。

2.3.3 供試品溶液移取時移液器引入的不確定度

同2.2.4,移液器的標準不確定度為u(V2)=1.400×10-3。 檢測時使用標稱容量為100—1 000 μL的移液器移取1 mL 待測樣品時,供試品溶液移取中移液器引入的相對標準不確定度為:urel(V2)=。

2.3.4 供試品引入的不確定度合成

將影響供試品的各個不確定度分量進行合成,得到供試品引入的不確定度urel3。

2.4 標準曲線的擬合引入的不確定度

按照粗多糖檢測的標準方法,以葡萄糖標準溶液質量濃度C1為橫坐標,吸光度檢測值A1為縱坐標(表1),求得標準曲線的回歸方程y = 0.010 3x +0.006,R2=0.999 8。 利用該方程,求得吸光度的理論值A2= 0.010 3C1+0.006 ,進而計算A1與A2的差值,根據貝塞爾公式計算殘差標準偏差SR。 其中,公式中的n 為標準曲線制作時測定的點數,即為6。

按照線性最小二乘法擬合直線的不確定度評估公式,計算標準曲線引入的不確定度。 其中,N為供2試)品;溶為液標的準測品定溶次液數中,標即準為品1 0質;C量x平為均供值試,品即溶4液9.按88回7 歸μg方∕m程L(計表算1的),質Cj量為濃第度j平次均測值量,標即準6 0溶.4液0 3中 μ葡g∕萄m L糖(表質量,Aj為第j 次測量對照品溶液吸光度。

表1 葡萄糖標準曲線繪制中的吸光度與標準溶液質量濃度Table 1 Absorbances and concentrations of standard solution in glucose standard curve

2.5 測定方法重復性引入的不確定度

對靈芝破壁孢子粉樣品進行10 次粗多糖含量的測定,結果見表2。 用貝塞爾公式,求得靈芝破壁孢子粉粗多糖含量的標準偏差為。 重復性的不確定度為u()==1.390×10-2,相對不確定度為。

表2 靈芝破壁孢子粉的粗多糖含量Table 2 Crude polysaccharide content in broken Ganoderma lucidum spore powder

2.6 紫外-可見分光光度計引入的不確定度

紫外-可見分光光度計引入的不確定度由葡萄糖標準溶液吸光度和供試品溶液吸光度兩部分組成。由紫外-可見分光光度計檢定證書可知其透射比誤差U= 0.3% (k= 2),因此其標準不確定度為。 標準品溶液吸光度平均值A0=0.519(表1),供試品溶液吸光度平均值Ax=0.625(表2),其相對不確定度分別為:

由于相對標準不確定度為上述兩個合成,即

2.7 合成不確定度的評估

靈芝破壁孢子粉中粗多糖含量測定的相對不確定度為:

標準不確定度為:

Urel = Urel總×樣品粗多糖含量=1.690×10-2×2.71% =0.045 8%

2.8 擴展不確定度的表示

當不確定度分布均勻且置信概率為0.95 時,擴展不確定度的包含因子k=2,其擴展不確定度U =2Urel =2×0.045 8% =0.09%,靈芝破壁孢子粉的粗多糖含量可表示為2.71%±0.09%(k=2)。

2.9 不確定度分量排序

通過比較各分量不確定度的大小,發現最主要的不確定度來源是標準品溶液配制稀釋過程中引入,其次為標準曲線擬合引入,然后是重復測量引入(表3)。

表3 靈芝破壁孢子粉的粗多糖含量測定各不確定度Table 3 Components of uncertainty in determination of crude polysaccharide content inbroken Ganoderma lucidum spore powder

3 結論與討論

通過對一個靈芝破壁孢子粉樣品的粗多糖含量檢測過程的不確定度進行全面評估,發現標準品溶液配置稀釋過程中引入的不確定度所占比例最大(表3),值得關注。 標準品溶液配制過程對不確定度的影響在其他參數的檢測方法不確定度評估中得到重視[17-19],但在粗多糖檢測不確定度評估研究中還未見報道。 葡萄糖標準曲線繪制時分兩步,第一步先配制成標準儲備液,再稀釋成一系列標準工作溶液,稀釋過程中引入的不確定度是該項不確定度來源的主要組成部分。 本試驗使用移液器來進行移液操作,而如果使用A 類1 mL 移液管,因其允差為±0.007,按三角分布(包含因子k=)計算其標準不確定度(u),結果為,高于移液器的標準不確定度1.400 ×10-3,即會增加不確定度。 當采用“分別吸取0.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL 和10.0 mL 的標準葡萄糖溶液至玻璃試管中并用蒸餾水補至10.0 mL,再吸取1.0 mL 的試液進行后續的苯酚硫酸顯色反應”的操作時,即便使用移液管,也可將此步的不確定度由現有的1.198 ×10-2降至7.810 ×10-3。 由此可見,增加標準工作溶液的配制量,可以有效降低標準曲線配制引進的不確定度,在實際檢測中具有較強的操作性。

標準曲線擬合引入的不確定度排名第二,這與此前的研究結果[9-10]有差異。 理論上,選擇精密度高的儀器,或增加標準曲線的測定點數,可降低標準曲線擬合引入不確定度,從而提高方法的可靠性。 然而,使用高精密度設備會增加成本,而若將標準曲線的點數增加到7 個或8 個,標準曲線擬合Urel 標曲由原來的9.418 ×10-3降為8.905 ×10-3或7.710 ×10-3,降幅并不顯著,在實際操作中可行性不強。

綜上,在用苯酚-硫酸分光光度法測定靈芝破壁孢子粉中粗多糖含量時,標準品溶液配制和標準曲線擬合是影響不確定度的主要因素,增加標準工作溶液的配制量可有效降低方法的不確定度,提高方法可靠性。