膠體金免疫層析法在豇豆農藥殘留檢測中的應用

◎ 潘喜芳，黃全書，施顯超，黃 霞，溫 娜，鐘英海，鐘昌宇

（1.廣西壯族自治區欽州市農產品質量安全檢測中心, 廣西 欽州 535099；2. 廣西壯族自治區欽州市欽北區農業農村局，廣西 欽州 535000；3. 廣西壯族自治區欽州市浦北縣農產品質量安全檢測站，廣西 欽州 535399；4. 廣西壯族自治區欽州市欽南區農產品質量安全監測管理站，廣西 欽州 535099）

豇豆又名菜豆、蕃豆，屬茄科豇豆屬，原產南美洲秘魯和智利，我國各地均有栽培。近年來，我國對豇豆的研究十分重視，不僅在生產上大力推廣應用豇豆品種、肥料配方與技術、農藥科學使用技術等方面的研究成果，而且在科學管理措施下提高了種植效益。但由于環境因素和管理措施等影響，豇豆中一些農藥殘留污染問題日趨嚴重。對豇豆中農藥殘留的研究主要集中在生產加工環節、使用過程及殘留檢測方法方面，對于使用的農藥在豇豆中是否存在高含量的殘留以及檢測技術等研究較少。同時，國內外對豇豆農藥殘留的檢測技術很少報道，在實際檢測中也難以保證豇豆農藥殘留的準確性。因此，迫切需要加強豇豆中農藥殘留分析的研究。

近年來，廣西壯族自治區農業農村廳持續加大對豇豆的農藥殘留監測力度。2015 年開始連續7 年要求各地市開展豇豆專項抽檢，采用定量法檢測甲胺磷、滅多威、毒死蜱等13 種農藥，2017 年增加氟蟲腈、啶蟲脒、苯醚甲環唑、烯酰嗎啉等29 種農藥。2022 年，農業農村部開始將豇豆列為例行監測必抽品種，將吡唑醚菌酯、甲維鹽、滅蠅胺等常規農藥和克百威、三唑磷、乙酰甲胺磷等禁用農藥作為必檢參數，并把豇豆農殘治理工作作為食品安全評議考核重點?！妒称钒踩珖覙藴适称分修r藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）規定最大殘留限量，克百威在豇豆上的限量值為≤ 0.02 mg·㎏-1，乙酰甲胺磷在豇豆上的限量值為≤ 0.02 mg·㎏-1，三唑磷在豇豆上的限量值為≤ 0.05 mg·㎏-1，吡唑醚菌酯在豇豆上的限量值為≤ 0.02 mg·㎏-1，滅蠅胺在豇豆上的限量值為≤0.5 mg·㎏-1，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在豇豆上的限量值為≤0.015 mg·㎏-1，氧樂果在豇豆上的限量值為≤0.02 mg·㎏-1，毒死蜱在豇豆上的限量值為≤0.5 mg·㎏-1，啶蟲脒在豇豆上的限量值為≤ 0.2 mg·㎏-1。

目前，現行有效地廣泛應用在我國新鮮果蔬中農藥殘留檢測的定性檢測方法分為酶抑制法和紙片法，檢測技術標準為GB/T 5009.199—2003，這2 種速測法只能進行有機磷類和氨基甲酸酯類檢測[1]。欽州市農產品質量安全檢測中心嘗試使用膠體金免疫快檢技術快速檢測方法檢測豇豆中的克百威、乙酰甲胺磷、吡唑醚菌酯、滅蠅胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽等9 種農藥，通過對其結果準確性進行測定和評價（依據農業農村部和農業農村廳例行監測和風險評估等結果），并同三重四級桿液相-質譜聯用儀結果進行對比分析，以解決農安監管難題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豇豆；克百威、乙酰甲胺磷、三唑磷、吡唑醚菌酯、滅蠅胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氧樂果、毒死蜱、啶蟲脒9 種農藥標準溶液（天津農業部環?？蒲斜O測所）。

1.2 儀器設備

克百威、乙酰甲胺磷、三唑磷、吡唑醚菌酯、滅蠅胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氧樂果、毒死蜱、啶蟲脒9 種農藥膠體金免疫層析速測卡；渦漩振蕩器，三重四級桿液相-質譜聯用儀（島津LCMS8040）；乙 腈(HPLC，Tedia Company)， 甲 醇(HPLC，Tedia Company)， 乙 酸 銨(LC-MS 級，CNW Technologies)，氯化鈉、無水甲酸(LC-MS 級，天津市光復科技有限公司)，超純水(Millipore 超純水機制備)，微孔濾膜(0.22 μm，Agela Technologies），QuEChERS 凈化管[50 mg PSA+150 mg MgSO4，島津技邇（上海）貿易有限公司]。

2 檢測方法

2.1 膠體金免疫層析法

檢測原理：采用競爭抑制免疫層析原理。首先，提取樣品中的農藥，將其與膠體金標記的特異性抗體結合；然后，抑制抗體和試紙中檢測線（T 線）上的抗原結合，從而產生檢測線顏色深淺的變化。通過對檢測線與控制線（C 線）顏色深淺進行比較，即可對樣品中的農藥進行定性判斷[2]。

2.2 定量分析

2.2.1 樣品前處理

準確稱取25.00 g(精確至0.01 g)勻漿后的豇豆樣品于100 mL 離心管中，加入50 mL 乙腈，5 ～7 g NaCl，用高速分散機以12 000 r·min-1均質提取2 min，以8 000 r·min-1高速離心5 min；吸取上清液1.5 mL置于QuEChERS 凈化離心管（50 mg PSA+150 mg MgSO4）中渦旋1 min，100 000 r·min-1離心5 min；取上清液過0.22 μm 濾膜，濾液待測。

2.2.2 色譜-質譜條件

色譜條件：SHIMADZUC18 柱子，色譜柱(φ1.9 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：40 ℃，流速0.2 mL·min-1；進樣量1 μL；流動相A 為0.5 mmol·L-1醋酸銨+0.01%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈；洗脫方式：梯度洗脫，有機相初始濃度為10%，4 min 有機相濃度50%，15 min 設置75%，17 ～20 min 設置95%。

質譜條件：電噴霧離子化離子模式（ESI）；掃描模式：多反應監測(MRM)掃描方式；離子源接口電壓：ESI+，+4.5 kV；ESI-，-3.5 kV；霧化氣：氮氣3 L·min-1；干燥氣：氮氣15 L·min-1；碰撞氣：氬氣；DL 管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：450 ℃；對9 種農藥單標溶液進行質譜參數優化，確定特征母離子和子離子。

3 實驗過程與結果分析

3.1 具體操作過程

制作3組樣品A、B、C，根據不同生產廠家（北京勤邦、廣州食源生物、美正生物）的膠體金檢出限值，對各組樣品添加不同濃度的標準物質（0.02 ～2.00 mg·kg-1），每組樣品設置3 個平行樣，分別為A1、A2、A3；B1、B2、B3；C1、C2、C3。將不同生產廠家的膠體金試紙檢測結果與液質聯用儀定量分析結果進行比對。

3.2 膠體金免疫層析法結果分析

表1 為三重四級桿液相-質譜聯用儀定量檢測結果。結果顯示，3 家公司生產的膠體金免疫層析速測卡檢測豇豆上的克百威、乙酰甲胺磷、三唑磷等9 種農藥在檢出限范圍內大多數都顯示陰性，超過檢出限范圍的顯示陽性，與液質聯用儀定量檢測結果一致或者相似，偶爾出現假陰性。此方法具有準確性高、針對性強，檢測條件受環境影響較小、檢測時間短等優點，可以基本滿足《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》 (GB 2763-2021)中規定的果蔬農藥殘留最大殘留量要求。

表1 三重四級桿液相-質譜聯用儀定量檢測結果表（mg·kg-1）

4 結論

農藥殘留檢測方法是評價農產品質量安全水平的重要指標之一，但目前許多檢測方法還存在一些不足。目前，我國已制定了30 多個農藥殘留標準，但不同地區、不同環境中的殘留農藥標準不統一且沒有相互銜接，這就導致了農藥的使用不能做到科學合理。另外，在豇豆生產中，由于種植方式的差異、豇豆病蟲害發生復雜多樣等原因，部分種植者為了追求高產高效，違規使用有毒有害的農藥，造成環境污染嚴重。因此，應建立適用于豇豆等農產品生產經營和銷售的殘留農藥檢測標準規范，從而保障豇豆生產安全和食用安全。由于我國對農產品中殘留農藥檢測技術尚缺乏成熟完善的經驗。因此，要建立適用于豇豆種植和銷售過程中殘留農藥檢測標準規范，就需要充分考慮該農產品在生產經營、市場銷售過程中的各種環境條件，以及在這些環境條件下所產生的殘留農藥種類、含量等方面因素的影響，這樣才能使這些方法更好地為農業生產實踐服務。

目前，國內農業技術推廣及農產品質量安全監管部門、市場監管部門、批發市場快速檢測室等使用的農藥殘留速測儀，主要針對有機磷類和氨基甲酸酯類農藥[3]，但是無法檢測菊酯類農藥殘留。膠體金免疫層析技術檢測快速、簡便、特異性強、靈敏度高，能滿足國家食品安全標準[4]。在已知施藥情況的果蔬農產品生產基地中，果蔬上市采摘前可以對相關農產品進行半定量檢測[5]，此類快速檢測產品的方法適合在基層農產品質量安全監管中推廣應用，適用于豇豆的種植和銷售過程中，農藥殘留檢測標準規范的建立及推廣應用。