澳洲堅果種植地土壤固氮微生物群落結構和多樣性

王瑞麗 施蕊 雷娥 李雕益 包書軍 熊智

摘要：采用qPCR和高通量測序技術對固氮相關基因（nifH）進行檢測，探究農業果園經營形式下土壤固氮微生物的群落結構、多樣性及其影響因素。結果表明，種植地pH值在5.0左右，屬于典型的酸性土。綜合分析發現，澳洲堅果園種植地帶養分含量明顯升高，并且種植區域養分含量也存在較大差異，說明土壤肥力分布不均。與未種植區域相比，種植區域固氮細菌（相關基因nifH）群落豐富度和多樣性指數均呈下降趨勢。變形菌門（Proteobacteria）為含nifH基因的固氮細菌群落優勢菌門，相對豐度為18.21%～79.69%，并且種植使土壤固氮菌群落結構發生了改變。實時熒光定量PCR結果表明，固氮相關基因（nifH）拷貝數在7.325×106～5.120×107之間。土壤理化因素與功能基因拷貝數相關性結果表明，nifH基因拷貝數與AK、OP、NH+4-N、NO-3-N、TN、OM等的含量均呈極顯著負相關。澳洲堅果種植地中固氮細菌以變形菌門（Proteobacteria）為最優勢的菌群，這為澳洲堅果種植地土壤肥力恢復和固氮微生物的開發利用提供了理論支持。

關鍵詞：澳洲堅果園；qPCR；高通量測序；固氮細菌；nifH；群落結構；多樣性

中圖分類號： S154.3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2023）08-0211-06

基金項目：國家自然科學基金（編號：3166010405）；云南省重大科技專項（編號：202002AA1007）。

作者簡介：王瑞麗（1995—），女，貴州安順人，碩士研究生，主要從事澳洲堅果功能微生物研究。E-mail：1393384429@qq.com。

通信作者：熊 智，博士，教授，主要從事微生物學和分子生物學研究。E-mail：zhix-swfu@qq.com。

氮元素是植物生長的必需營養元素之一，對植物光合作用和增產起關鍵作用［1］。土壤固氮微生物是一類能將大氣中游離氮轉化為含氮有機物的原核微生物，其數量和群落結構的變化與土壤氮素循環密切相關［2-3］。固氮微生物的固氮作用主要依靠其體內的固氮酶，它們都依賴于nifH編碼固氮酶鐵蛋白亞基的基因，可廣泛用于檢測不同環境下固氮作用的基因［4］。大量nifH基因的研究表明，土壤有機質和氮肥會顯著影響固氮微生物的物種數量和群落多樣性［5］。田永輝等的研究表明，種植年限會影響茶樹根際固氮微生物的群落組成和多樣性［6］。陳秀波研究發現，植被種類、土壤理化性質、土壤施肥措施等因素會影響固氮微生物群落和多樣性的變化［7］。張苗苗等分別利用熒光定量PCR和末端限制性片段長度多樣性（T-RFLP）技術研究了長期不同施肥處理對固氮基因的豐度和群落多樣性的影響，結果表明，與不施肥處理相比，稻草還田和施氮磷鉀（NPK）處理都能顯著增加固氮基因的豐度，而秸稈配施NPK處理的nifH基因豐度最高，因而可以增加土壤固氮能力；此外，長期不同施肥處理顯著改變了群落結構，但是對群落多樣性沒有顯著改變［8］。Wu等研究了施氮量和水稻品種對根系固氮細菌多樣性的影響，結果表明，氮肥和水稻品種都會顯著影響根系土壤固氮微生物的群落結構，β-變形菌是最主要的水稻根系固氮菌，施用氮肥會顯著降低α-變形菌的相對豐度［9］。Tan等的T-RFLP研究結果表明，施氮肥15 d后水稻根系固氮微生物群落迅速發生改變，即固氮微生物群落受到氮肥的影響，環境條件和水稻品種對根系固氮微生物群落有顯著影響［10］。固氮的富集改變了功能性固氮基因的豐度，固氮菌的數量越大，根際氮輸入量越大，有利于植物入侵。大量林地生態系統研究表明，氮循環微生物受pH值、土層深度和季節等因素影響。柳建銀研究發現，同一領域的紅樹林土壤樣品中，固氮微生物群落組成存在差異［11］。Mergel等通過靶定nifH基因，探究德酸性林地土壤固氮細菌種群，發現固氮菌群數量在0～5 cm土層最高，并隨土壤深度增加而降低［12］。Zhou等的研究表明，溫度對森林土壤功能菌群變化方面比其他擬議的環境驅動因素起著更主要的作用［13］。

云南省是我國最大的澳洲堅果種植區，主要分布于西雙版納、普洱、臨滄、保山、德宏等地市州。目前，澳洲堅果已經成為云南部分地區脫貧攻堅、鄉村振興的重點產業之一［14］。云南省近年大力發展高效林果業，目的是改善澳洲堅果林的生態環境，最終實現澳洲堅果優質高產。并且，澳洲堅果樹是云南省主要代表果樹種之一，具有滋養水土的作用，對土壤肥力改善和土壤生態恢復具有積極的影響。目前關于人工農業果林生態系統中土壤固氮微生物的研究相對缺乏。

本研究以未種植澳洲堅果樹區域與種植區域土壤為研究對象，探討了種植澳洲堅果樹對土壤理化性質、土壤養分和群落特征等方面的影響，并且從基因水平上進一步研究土壤微生物營養元素循環提供參考。另外，可以比較種植地再利用方式的效果，為生態修復、功能微生物開發與利用、土壤肥力恢復等提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集與處理

土壤樣品于2019年6月在云南省江城縣嘎勒村澳洲堅果種植基地采集。樹種選取2013年種植的澳洲堅果樹，土壤采集方法是按“S”形路線取樣法，土壤深度為5～30 cm，每棵樹分別在東西南北4個方向采集等量的土樣，并去除土樣中的雜質，混勻后裝入高溫滅菌的采樣袋中，分裝2袋，一袋放在-80 ℃冰箱保存，另一袋4 ℃保存用于測定土壤養分。共取4個區域的土樣，A0表示非種植區域的土樣，A1、A2、A3代表種植地帶的土樣（表1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤養分測定 土壤pH值：分別取1袋土樣置于pH值為4.01、6.86、9.18的標準緩沖液中，蒸餾水定容至100 mL，搖勻即配制成相應的標準液，然后使用智能型漢顯多功能養分速測儀測定土壤pH值。

土壤速效鉀（AK）、有效磷（OP）、銨態氮（NH+4-N）和有機質（OM）含量：根據智能型漢顯多功能養分速測儀所提供的試劑配制標準溶液，使用特定的顯色劑與標準溶液發生顯色反應，然后按照相應的操作步驟測定其含量。

硝態氮（NO-3-N）含量：取5 g風干土樣于三角瓶內，加入0.5 g CaSO4·2H2O和100 mL蒸餾水，蓋塞后在振蕩機上振蕩10 min。放置5 min后將上清液過濾于干燥潔凈的三角瓶內。吸取25 mL上清液于 100 mL 顯色管中，分別加入0.05 g CaCO3、酚二磺溶液2 mL、純水10 mL，1 ∶1氨水先加至溶液呈黃色，再補加3 mL，定容至100 mL后在分光光度計上于410 nm處比色。

1.2.2 土壤固氮微生物群落結構和豐度的測定

1.2.2.1 DNA提取 從-80 ℃冷柜中稱取根際土壤0.2 g，按照土壤總DNA提取試劑盒的步驟提取總DNA，DNA純度和濃度用NanoDrop2000進行檢測，DNA提取效果用瓊脂糖凝膠電泳技術檢測，檢測能跑出清晰條帶的DNA方可進行下一步試驗。

1.2.2.2 高通量分析 根據查得的固氮作用nifH引物序列擴增要求，對提取成功的土壤總DNA進行PCR試驗，每個樣品3個重復。正向引物F：5′-[JP9]AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′；反向引物 R：5′-[JP9]TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′。 PCR反應體系：5×FastPfu Buffer緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正反向引物各0.8 μL，FastPfu聚合酶 0.4 μL，BSA 0.2 μL，DNA模板 10 ng，雙蒸水補至20 μL。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，75 ℃ 45 s，37個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。由上海美吉生物醫藥科技有限公司利用美吉生物服務平臺完成氮循環功能基因的測序。

1.2.2.3 實時熒光測定PCR 標準曲線制備：每個功能基因實時熒光定量的質粒均按照10倍稀釋梯度建立，90 μL稀釋液和10 μL質粒，通過對各功能基因預試驗，nifH功能基因取10-8～10-2稀釋液繪制。反應體系共20 μL：qPCR反應混合物16.5 μL，上下游引物0.8 μL，DNA模板2 μL。PCR循環條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，75 ℃ 1 min，40個循環。完成DNA聚合酶鏈式反應后，將所有樣本放入熒光定量 PCR 儀中反應。定量PCR反應完成后設置溶解曲線用以檢驗產物的特異性。

1.2.2.4 結果計算 拷貝數（copies/μL）=DNA濃度（ng/μL）×10-9×6.02×1023/（分子量×660），式中分子量指載體的大小加上目的基因的片段大小。

2 結果與分析

2.1 土壤指標分析

由表2可知，未種植區域土壤中AK、OP、NH+4-N、NO-3-N、TN、OM含量明顯低于種植區域，差異顯著（P<0.05）；種植區域各土樣除TN含量差異不顯著外，其他理化指標都存在顯著差異（P<0.05），說明種植區土壤肥力不均。

2.2 參與固氮作用的nifH基因群落結構和多樣性

2.2.1 nifH基因群落分類和多樣性

高通量測序結果（表3）顯示，在種植區域與未種植區域中一共得到74 397條有效序列，其中未種植區域得到 13 661 條有效序列，種植區域每個樣本平均獲得 20 245 條，測序量能夠滿足后續的分析需要。未種植區域有效序列條數明顯低于種植區域，操作分類單元（OTU）數量明顯高于種植區域。所采土樣覆蓋度均在99.59％以上，說明土樣中的固氮細菌均能被檢測到，即所測土樣中固氮細菌可以完全反映土樣情況。

根據相似度對所獲得的有效序列進行OTU劃分。所有樣本序列共分為1 334種OTU，通過與nifH型數據庫比對，這1 334種OTU分別歸屬于3域3界8門13綱21目25科29屬38 種。從總體來看，未種植區域固氮作用nifH基因OTU數量最多，說明種植會降低OTU數量，種植區域各土樣OTU數量間也存在顯著差異，說明土壤肥力不均。

由各樣本的多樣性指數（表4）可知，未種植區域參與固氮作用的nifH基因的物種豐富度指數明顯比種植區域高，說明種植會降低物種豐富度。與未種植區域相比，種植區域物種多樣性指數明顯降低，并且種植區域間也存在差異，說明種植區域由于長期大量施氮造成土壤肥力相差較大，從而降低了固氮微生物nifH的多樣性。從2個均勻度指數可以看出，種植區域土壤的均勻度低于未種植區域，表明種植會降低固氮細菌nifH的均勻度，同時種植區域之間也存在差異，有可能是施肥不均造成。

2.2.2 nifH基因韋恩圖 為了便于比較，對種植區域與未種植區域所采土樣進行核心OTU分析（即在給定組內所有樣品之間共享OTU），它們對應于4組，包括未種植區域（A0）、種植區域（A1、A2、A3）（圖1）。未種植區域僅有526個核心OTU局限于單獨的組，而種植區域分別有129、78、102個核心OTU分別局限于單獨的組，共有89個核心OTU為所有組共享的，種植區域中所采樣本與未種植區域共享的OTU分別為205、182、246個，說明種植澳洲堅果樹會嚴重影響土壤固氮微生物群落的相似性。

2.2.3 nifH基因的群落柱形圖 由圖2可知，在門水平上，固氮作用nifH基因的群落共有8類物種組成，其中變形菌門（Proteobacteria）是主要物種，在各個土樣中的相對豐度介于18.21%～79.69%之間，尤其在A0、A3土樣中分別達到68.44%、79.69%，而在A1、A2土樣中分別只有18.21%、38.70%。其次是未分類的物種，相對豐度范圍為17.60％～81.29％，所占比例只比變形菌門低15.22%。在A1、A2、A3土樣中還分布著藍藻門（Cyanobacteria），相對豐度分別為0.13%、0.32%、0.18%，同時在A3土樣中還發現了厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和廣古菌門（Euryarchaeota），相對豐度分別為0.05%、0.14%、0.02%。

由圖3可知，在所有樣本中均以未分類的物種相對豐度最高，未種植區域可達30.58%，種植區域最高可達81.29％，最低是17.60%；其次是變形菌門（Proteobacteria），未種植區域豐度可達22.18%，種植區域最高可達33.17％，最低是4.10%。種植區域紅微菌屬（Rhodomicrobium）的相對豐度明顯比未種植區域高，未種植區域的相對豐度為9.3%，而種植區域的分別為2.15%、27.53%、17.13%。未種植區域未分類根瘤菌目（Rhizobiales）的相對豐度明顯比種植區域高，其在未種植區域的相對豐度為18.25%，而種植區域分別為0.90%、4.46%、5.34%?？傮w而言，種植會影響土壤固氮微生物的群落組成和群落間的豐度。

2.2.4 nifH基因的系統發育分析 采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法選取總豐度排前35位的OTU代表序列與NCBI數據庫比對，下載相似性最高的序列，利用MEGA 7.0構建進化樹。如圖4所示，所得序列與NCBI數據庫的基因序列相似性為75.57%～100%，樣本OTU根據門水平，可大致分為硝化螺菌門（Nitrospirae）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和未知菌類（unclassified）4個門類。在前35位OTU內，A1土樣中有35條，A2土樣中有23條，A3土樣中有28條，A0土樣中有23條。與硝化螺菌門相似的序列有17條，A1土樣中有3條，A2土樣中有3條，A3土樣中有9條，A0土樣中有3條。與放線菌門相似的序列，A1土樣中有16條，A0土樣中有2條。與變形菌門相似的序列有4條，A1土樣中有3條，A0土樣中有2條，序列相似度為76.19%～99.72%。其他序列與未知菌類的nifH基因相似，序列相似度為75.57%～100.00%。

2.3 固氮基因實時熒光定量

2.3.1 nifH基因標準曲線 對所有功能基因進行實時熒光定量，并繪制標準曲線。由圖5可知，固氮作用nifH型細菌的決定系數（r2）為0.998 6，說明此次定量的數據精確；擴增效率為99.74%，可以達到繪制標準曲線的要求。根據標準曲線計算，發現澳洲堅果種植地固氮相關基因（nifH）的拷貝數在7.325×106～5.120×107之間。

2.3.2 nifH基因與理化因子相關性分析 由表5可以看出，固氮細菌nifH基因的豐度與AK、OP、NH+4-N、NO-3-N、TN、OM[JP+2]等的含量在0.01水平上呈顯著負相關。

3 討論與結論

本研究表明，種植地帶固氮基因nifH的多樣性和豐富度顯著降低，種植地帶長期施肥顯著影響了含nifH基因的固氮細菌群落結構。取樣時避過施肥區域，但種植區域群落結構還是存在差異，說明土壤肥力是區分不同群落結構的最主要因素之一。變形菌門（Proteobacteria）為含nifH基因的固氮細菌群落優勢菌門，相對豐度為18.21%～79.69%。此外，在種植區域均發現藍藻門（Cyanobacteria）的固氮菌群，這與江西紅壤中的研究結果［15］相似。董志新等的研究表明，固氮微生物的多樣性受土壤因素和種植條件的影響［16］。Hai等的研究表明，高粱秸稈與牛糞配施能增加固氮菌的數量，促進土壤氮素的固定，降低氮素的損失［17］。Wang等發現，表層土壤的土壤有機碳（SOC）含量和銨態氮的濃度與固氮細菌的群落結構有顯著的正相關關系，這說明土壤理化性質對表層土壤固氮細菌的群落具有選擇性［18］。Sharma等也發現，土壤濕度、有機質含量和礦質氮的濃度是影響固氮細菌群落結構和豐度的主要因素［19］。

本研究通過對固氮細菌實時熒光定量分析，發現澳洲堅果種植地固氮相關基因（nifH）拷貝數在7.325×106～5.120×107之間，孟晗研究發現旱地土壤中細菌的拷貝數在106左右［20］，兩者結果基本一致。本研究還發現種植澳洲堅果會明顯降低固氮菌群nifH的基因拷貝數，種植區域較未種植區域基因拷貝數呈明顯的下降趨勢，這可能是由于施肥造成的，這與李帆研究青藏高原高寒草甸土壤中自生固氮細菌群落組成的結果［21］一致。

本研究表明，種植區域土壤養分含量明顯比未種植區域高。土壤固氮微生物豐度與養分元素的相關性分析結果表明，速效鉀、有效磷、銨態氮、硝態氮、全氮、有機質含量對nifH基因拷貝數具有極顯著的影響，并且對基因拷貝數呈負相關性，這與李帆研究土壤中自生固氮微生物的群落結構［21］一致。蘭鴻珠等研究濕地鹽節木泥土中固氮細菌的群落結構和功能基因拷貝數，發現功能基因拷貝數與硝態氮、速效氮含量等存在相關性［22］。

本研究為研究和利用澳洲堅果種植地中的固氮細菌提供了基礎依據。另一方面可以比較澳洲堅果種植地再利用方式的效果，為生態修復、固氮微生物開發與利用、土壤肥力恢復等提供科學基礎。

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