應用qPCR研究三峽庫區沉積物中擬多甲藻的動態變化
——以汝溪河為例

施軍瓊， 向蓉， 何書晗， 歐陽添，趙璐， 紀璐璐， 楊宋琪， 吳忠興

西南大學 生命科學學院/三峽庫區生態環境教育部重點實驗室/重慶市三峽庫區植物生態與資源重點實驗室，重慶 400715

三峽庫區175 m 正常蓄水運行后, 從上游至下游, 水位升高約3～100 m, 導致了支流水文情勢發生明顯變化, 如水面變寬、 水流減緩、 泥沙含量降低等． 流速減緩, 使得支流回水區成為湖泊型水體[1-4]． 此外, 由于氮、 磷的輸入, 支流富營養化趨勢凸顯[5-6], 因此, 部分支流庫灣藻類水華現象已成為淡水生態學和水環境科學研究的焦點及水質管理部門關注的重點[7-8]．

甲藻是一類能夠形成孢囊(休眠細胞)的藻類, 其休眠性孢囊在適宜的環境條件下會迅速啟動萌發機制, 并在短時間內大量增殖, 甚至形成水華現象; 當環境條件不適宜時, 又會大量形成孢囊, 在底泥沉積, 躲避不利環境[9], 因此, 甲藻孢囊不僅為甲藻水華暴發提供“種源”, 而且在甲藻水華的發生和消亡中也具有重要作用[10]． 2004年, 三峽庫區首次報道了擬多甲藻水華[11]． 緊接著, 庫首第一支流香溪河也發生擬多甲藻水華[12]． 據不完全統計, 高嵐河、 汝溪河、 彭溪河、 童莊河、 大寧河、 梅溪河、 小江等多條支流回水區均發生了該藻類水華, 且一些支流發生頻度較高[8, 13-15]． 擬多甲藻水華在支流回水區中發生范圍最廣、 持續時間最久[8]． 研究已表明, 水體理化[16-17]、 水文氣象[12, 18]、 浮游植物、 原生動物和浮游細菌群落多樣性及豐度[19]、 水體熱分層與擬多甲藻的種群變化和水華形成具有較大影響[20], 但這些研究主要集中在水體擬多甲藻水華的影響因素, 卻很少關注底泥中擬多甲藻的變化, 因而并不能全面揭示庫區擬多甲藻水華的生消過程．

目前, 對底泥甲藻進行定性定量分析中, 普遍使用的沉積物處理方法為篩網過濾法和孢粉學處理法[21]． 篩網過濾難免造成損失, 甲藻孢囊又容易與大量的有機碎屑混雜在一起, 從而導致分析結果不能準確反映沉積物中孢囊的分布狀況, 因此, 為了準確了解擬多甲藻在底泥中的分布情況, 本文建立了基于qPCR定量分析三峽庫區汝溪河支流回水區底泥中甲藻動態變化的方法, 并對其影響因子進行分析, 以期為庫區甲藻水華防治工作提供一定的理論基礎和技術支撐．

1 材料與方法

1.1 樣點設置

汝溪河發源于萬州區分水鎮, 流經培文鎮, 在梁平區境內和汝溪河另一支流交匯, 經忠縣汝溪鎮, 最后經涂井鄉匯入長江． 全流域面積720 km2, 主河道長54.5 km, 在忠縣境內流域面積272.9 km2, 主河道長25.4 km． 多年平均徑流總量達1.49×109km3, 是三峽庫區重要的一級支流之一． 水庫蓄水后, 長江水淹沒至涂井鄉以上, 形成了長達15 km的汝溪河回水區． 汝溪河支流每年3-5月在涂井鄉至龍灘大橋回水區常發生嚴重的甲藻水華[22]． 為了監測汝溪河底泥甲藻的動態特征, 在汝溪河涂井鄉至龍灘大橋設置3個斷面(T1-T3), 如圖1．

圖1 研究斷面分布圖

1.2 底泥采集及DNA提取

2016年3月至2017年2月的每個月在每個斷面的左(S1)、 中(S2)和右(S3)3個樣點利用柱狀采泥器進行底泥采集． 采集后測定溫度并裝入自封袋密閉避光保存, 當天帶回實驗室置于-20 ℃冰箱保存備用． 沉積物經過風干后, 取泥土樣2 g于10 mL離心管中, 采取CTAB法提取DNA[23]． 干燥后的DNA溶解于50 μL ddH2O中, 測定吸光度A260和A280, 若A260/A280在 1.8～2.0 之間則置于-20 ℃冰箱保存備用, 否則需要進一步純化或重新提?。?/p>

1.3 PCR擴增及甲藻系統發育樹構建

用于PCR擴增28S rDNA基因的引物為DinFif (5′GCATATAAGTAMGYGGWGG3′)和DinRir (5′CCGTGTTTCAAGACGGGTC3′)[24]． 50 μL 反應體系: DNA模板為2 μL, 其余組分按Taq酶(TaKaRa, 日本)說明書的量添加． PCR 反應結束后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳, 目的片段回收純化后進行測序(英濰捷基上海貿易有限公司), 獲得816 bp序列． 采用Clustal方法進行比對和序列間的遺傳變異度分析(Vector10軟件, Invitrogen, 美國)． 利用獲得的816 bp序列與GenBank中的序列進行比對, 通過MEGA5構建最大似然樹(Maximum likelihood, ML)． 通過自展法分析系統樹的穩定性和一致性, 其中各節點代表支的統計置信度以50%為標準[25]．

1.4 實時熒光定量PCR

1.4.1 定量PCR引物設計

根據1.3獲得的序列, 采用Vector 10軟件進行qPCR特異性的引物設計, 引物序列為uPr1(5′GTCAAATTGAGCCGCAAGCTCC3′)和uPf1(5′ATCCGCCTTCGGCACCGTAT3′), 產物片段長度為128 bp, 引物由上海生工合成．

1.4.2 質粒制備

利用挑取的原位水體擬多甲藻作為藻株, 以引物uPf1和uPr1擴增的基因片段回收后通過TA克隆連接到pMD19-T載體(Takara, 日本), 轉化感受態Escherichiacoli細胞DH5α, 挑取陽性克隆過夜培養, 質粒的提取采用質粒小提試劑盒(天根, 北京)． 選取擴增片段上沒有而載體也僅單一酶切位點的DNA內切酶Hind III(Fermentas, 美國)進行酶切, 線性化的質粒電泳回收后溶于ddH2O制備成標準品原液, 其質粒濃度用NanoDrop 1000進行測定(Thermo, 美國), 并根據公式換算成質粒的拷貝數:

Cn=Pc×10-9×6.02×1023/PL×660

式中,Cn為拷貝數(個/L),Pc為質粒濃度(ng/mL),PL為質粒長度(bp)． 將重組質粒標準品原液做7個10 倍的梯度稀釋, 為qPCR的標準梯度樣品, -80 ℃保存．

1.4.3 標準曲線繪制

7個濃度梯度的質粒標準品作為模板, 進行SYBR Green I qPCR反應(ABI7500, 美國)． 每個濃度做3個重復, 并加陰性對照． 反應程序: 94 ℃預變性5 min, 94 ℃變性30 s, 54 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸40 s, 35個循環; 72 ℃延伸5 min． 為了建立基因拷貝數對數值與qPCR反應循環閾值(熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數,Ct)之間的線性回歸方程, 以qPCR反應中相應的Ct值為縱坐標, 模板DNA拷貝數的對數值為橫坐標, 繪制標準曲線．

1.4.4 樣品檢測

環境樣品中DNA經過適當稀釋, 作為模板進行qPCR反應, 將Ct代入標準曲線獲得此樣品的拷貝數及其原始環境中的濃度．

1.5 水體理化及底泥營養鹽的測定

水體的水溫(WT)、 pH、 電導率(EC)、 溶解氧(DO)、 氧化還原電位(ORP)、 濁度(Tur)和水下光照(PAR)現場通過多參數水質分析儀(DS5X, HACH, 美國)進行測定． 將采集的底泥烘干后磨碎, 利用CHNS-O元素分析儀(Hanau, 德國)測定底泥中C和N的質量分數． P, Ca和K質量分數采用硝酸、 雙氧水和微波消解儀(Milestone ETHOIS, 意大利)消解后, 用電感耦合等離子光譜儀(ICP-OES, 德國)測定．

1.6 數據分析與處理

汝溪河每季度甲藻拷貝數量與環境因子的關系采用SPSS 22.0軟件(IBM, 美國)進行多元逐步回歸分析． 甲藻拷貝數和環境因子通過Origin 8.0(Originlab, 美國)進行Pearson相關性分析, 并進行F檢驗．

2 結果與分析

2.1 汝溪河甲藻系統發育

利用汝溪河甲藻和GenBank藻類的28S rDNA序列構建甲藻系統發育樹, 以最大似然法(ML)構建的系統進化樹如圖2． 結果表明, 汝溪河優勢甲藻與倪氏擬多甲藻(Peridiniopsisniei)關系最近, 節點支持率為94%, 且與東湖倪氏擬多甲藻(P.nieiHM596555)和三峽庫區香溪河倪氏擬多甲藻(P.nieiFJ 767867)相似度分別為100.0%和99.7%． 該藻細胞卵圓形, 背腹略扁平, 上殼錐形, 下殼略呈錐形且有兩根短刺或無刺, 縱溝寬, 上下板片大小幾乎相等且板片表面具不規則乳突狀, 具紅色眼點, 藻細胞長約30 μm, 寬約25 μm． 形態學和分子系統學結果均表明, 汝溪河甲藻為倪氏擬多甲藻．

節點處數字顯示高于 50%的節點支持率．圖2 28S rDNA 序列的系統進化樹

圖3 質粒標準品的熒光定量PCR標準曲線

2.2 熒光定量PCR標準曲線

為了驗證設計的qPCR引物的特異性, 利用樣品DNA進行qPCR擴增, 結果顯示溶解曲線峰值單一, 說明該引物對野外樣品DNA特異性較好． 克隆質粒標準品經qPCR后結果表明, 各梯度標準品擴增正常, 標準曲線為y=32.58-2.57x,R2=0.999 6, 其中y為Ct,x為模板DNA拷貝數的對數值, 線性良好(圖3), 因此, 引物uPr1和uPf1的qPCR可以用于定量汝溪河水華甲藻的拷貝數．

2.3 底泥中擬多甲藻的動態變化

汝溪河底泥樣品甲藻的動態變化如圖4． 3個斷面T1, T2和T3的左(S1)、 中(S2)、 右(S3)樣點的底泥甲藻拷貝數均在3-5月間達到最大值． T1和 T3兩個斷面左樣點的每克干燥底泥甲藻基因拷貝數均在4月達到最大值, 為70.18×103個/g和42.77×103個/g; T2斷面的S1樣點拷貝數在5月達到最大值, 為68.60×103個/g． T1,T2兩個斷面的S2和S3樣點均在4月達到最大值, 而T3斷面的S2,S3樣點則是在9月和5月達最大值． 隨著季節的變化, 底泥甲藻拷貝數也有所不同, 其中春季3個采樣斷面S1, S2和S3的甲藻拷貝數顯著高于夏、 秋、 冬季(p<0.05)． 四分位結果表明(圖5), 春季拷貝數分布較零散, 但從平均值來看, 春季拷貝數均高于其他3個季節; 夏、 秋和冬3個季節拷貝數差異無統計學意義, 且S1, S2和S3甲藻拷貝數春季差異無統計學意義(p>0.05)．

S1, S2和S3分別表示斷面的左、 中、 右樣點．圖4 汝溪河底泥中甲藻的動態變化(2016-2017年)

圖5 汝溪河底泥中甲藻的季節變化

2.4 底泥擬多甲藻變化與環境因子的關系

各樣點底泥的溫度均為夏季最高, 保持在30 ℃左右, 其次為秋季、 春季和冬季． 春季底泥的溫度維持在20 ℃, 而冬季底泥溫度最低, 僅為14.5 ℃． 春季底泥總氮(TN)質量分數最高, 其他3個季節TN質量分數變化不大． 對于總碳(TC)質量分數, 各樣點春季底泥最高, 其次為冬季． 冬季總磷(TP)質量分數最高, 保持在0.5 mg/g左右, 其次為秋季、 夏季和春季, 春季保持在0.1 mg/g左右． Ca和K元素4個季節差異無統計學意義． 從全年來看(圖6), 底泥中甲藻拷貝數與泥溫、 TP和C/P呈線性負相關(p<0.05), 與N/P呈顯著正相關(p<0.05), 但與底泥中的TN, TC, Ca和K質量分數無顯著相關性(p>0.05)． 對不同季節底泥甲藻拷貝數與環境因子進行多元逐步回歸分析(表1), 結果發現, 甲藻拷貝數與環境因子之間逐步回歸相關系數均在0.7以上, 其中, 春季甲藻拷貝數與泥溫顯著相關(p<0.05), 相關系數為0.824; 夏季甲藻拷貝數的主要影響因子是Ca和K, 相關系數達0.997; 秋季和冬季的甲藻拷貝數分別與TN和TC顯著相關, 相關系數為0.735和0.885．

表1 汝溪河不同季節底泥甲藻拷貝數與環境因子逐步回歸分析

圖6 底泥甲藻拷貝數與泥溫, TP, N/P和C/P的相關性分析

3 討論

3.1 實時定量PCR在汝溪河底泥甲藻的應用

孢囊是甲藻生活史中一個特殊且重要的階段, 在甲藻種群延續及水華形成過程中起著重要的作用[26-27]． 傳統的甲藻分類在生態學研究中面臨著許多問題: 一方面, 有賴于專業技術及經驗性, 并且不同分類學家的分類標準也不完全一致; 另一方面, 因環境的變化而變化的表型特征給鑒定帶來一定的困難[21]． 隨著分子生物學的發展, Scholin等[28]采用 LSU-rDNA 部分片段序列研究了亞歷山大藻(Alexamdrium)的系統進化, 發現A.tamarense,A.catenella和A.fundyense等相似物種能被很好區分開來． Lee等[29]通過LSU-rDNA 系統樹分析, 認為韓國水域的Amphidiniummassartii能明顯與澳大利亞、 美國和加拿大等地區的藻株區別開來． Saldarriaga等[30]和Zhang等[31]利用LSU和SSU rDNA序列分析了淡水甲藻發育系統, 證實了該序列的甲藻系統發育． 蘇玉萍等[32]通過單細胞LSU-rDNA鑒定出福建省九龍江底泥中孢囊優勢種為佩氏擬多甲藻(Peridiniopsispenardii)． 本研究基于NCBI(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)甲藻及汝溪河甲藻的LSU-rDNA序列, 構建系統發育樹, 結果表明汝溪河的甲藻和擬多甲藻屬的多個物種相似性很高, 其中與香溪河和東湖采集的倪氏擬多甲藻相似度分別達到99.7%和100.0%, 因此, 從分子水平上支持了汝溪河的甲藻為倪氏擬多甲藻．

3.2 環境因子對底泥甲藻動態變化的影響

關于擬多甲藻水華的研究已經被廣泛報道, 如三峽庫區香溪河[14, 33]、 三峽庫區童莊河[34]、 貴州省黔東南州三板溪水庫[35]、 武漢東湖[12]等． 這些研究發現擬多甲藻水華與TP, TN, NO3-N, N/P, 水體分層等多種因素相關． Pollingher等[36-37]認為甲藻孢囊形成于水華末期, 其他研究表明孢囊形成則發生于整個水華期間[38]． 本研究經過熒光定量PCR方法發現, 汝溪河底泥中每個月均存在甲藻孢囊, 1月、 2月和6-12月底泥甲藻拷貝數差異無統計學意義, 在3-5月不同樣點底泥甲藻均達到最大值, 即春季甲藻拷貝數最高(圖4和圖5), 支持了Pollingher等[36-37]的結論, 即水華末期(5月末)可能是甲藻孢囊形成的重要時期, 而春季應該是甲藻孢囊大量增殖的高峰期．

海底沉積物溫度、 生產力也是甲藻孢囊分布的主要影響因素[39-41]． 邊歸國等[17]研究發現, 甲藻可在10～28 ℃大量繁殖． 本研究發現隨著底泥溫度的增加, 底泥甲藻呈現出下降的趨勢(圖6), 春季(3-5月)底泥溫度基本維持在20 ℃左右, 因此, 春季底泥甲藻水體溫度適宜甲藻的大量繁殖． 通過逐步回歸分析(表1)發現, 春季底泥甲藻拷貝數與底泥溫度呈顯著相關, 夏、 秋季底泥溫度相對較高, 而冬季底泥溫度相對較低, 對甲藻繁殖均有一定的抑制作用[42]． 鄭磊等[43]研究表明, 大鵬灣表層活性磷質量分數高但氮磷比較低的沉積物有利于甲藻孢囊的分布． 研究已發現甲藻水華通常出現在有機物質豐富的水體中[33-34, 44-45], 特別是氮、 磷質量分數豐富的水體中[12]． Sako等[46]發現N, P質量分數對甲藻孢囊的形成具有非常重要作用． 本研究發現, 底泥甲藻變化與TP和C/P比呈負相關關系, 與N/P呈顯著正相關, 且回歸分析發現, 春、 夏和秋季甲藻拷貝數分別與泥溫、 Ca和K, 以及TN的質量分數顯著相關(圖6, 表1), 支持了鄭磊等[43]的研究, 即營養鹽變化可能也是汝溪河擬多甲藻動態變化的重要原因之一． 有研究也表明不同的磷濃度和磷形態對擬多甲藻生長具有顯著的影響[47], 因此, 推測三峽庫區磷濃度及磷形態的變化對三峽庫區擬多甲藻水華形成具有重要作用． 此外, 逐步回歸分析發現汝溪河底泥冬季甲藻的數量與TC質量分數呈正相關(表1), 說明甲藻水華的發生在一定程度上與有機碳緊密相關． Stéphanie等[48]發現甲藻孢囊的分布與所研究區域的水動力條件、 水文和選擇性沉積條件相關, 因此, 要全面揭示三峽庫區底泥擬多甲藻的動態變化及水華的形成機制, 需要多種因素綜合研究．

3.3 汝溪河甲藻水華的防控

擬多甲藻受光照、 溫度、 營養鹽成分和其他環境條件的共同影響, 在三峽庫區表現出較為復雜的生活史． 研究表明, 擬多甲藻可以在較廣溫度范圍(10～28 ℃)下大量繁殖, 生長的最佳溫度為13～15 ℃[17]． 甲藻生長在水流速度較慢的水體中, 臨界流速為0.2 m/s, 當水體流速大于臨界值時, 甲藻的生長會受到抑制[17]． 甲藻的部分種類可以形成孢囊沉入水底, 在環境條件不利時渡過休眠期, 當條件再次適合時, 孢囊則會迅速萌發, 進入水體進而急劇增加, 形成水華[9, 10]． 三峽庫區成庫蓄水后, 水庫回水區的流速變緩, 營養物質沉降并大量積累, 支流甲藻水華持續發生, 并呈逐年加重趨勢[8, 14-15], 因此, 增加水庫回水區的流速, 可降低甲藻水華的發生[49]． 此外, 本研究結果發現春、 夏、 秋、 冬季甲藻拷貝數與泥溫、 Ca和K, TN, TC顯著相關, 表明庫區支流水體營養增加會促進甲藻水華的發生, 因此, 為了有效控制庫區甲藻水華, 可因地制宜建設農業生態工程． 這樣有利于減少流域兩岸鄉鎮生活污水、 垃圾和畜禽養殖場糞便等污染物未達標處理的排入, 減少有機物和含氮物質的污染, 維護并保持完整的水生生態系統的健康, 增加水體的自凈能力．

4 結論

1) 基于汝溪河底泥沉積物甲藻的形態學特征及LSU-rDNA系統發育樹分析, 此甲藻為倪氏擬多甲藻．

2) 引物uPr1和uPf1可用于汝溪河水華甲藻的實時熒光定量PCR, 其標準曲線為y=32.58-2.57x,R2=0.999 6．

3) 3個采樣斷面左、 中、 右樣點的底泥甲藻拷貝數均在3-5月達到最大值, 且春季底泥中甲藻拷貝數顯著高于夏、 秋和冬季．

4) 底泥中甲藻拷貝數與泥溫、 TP和C/P呈線性負相關, 與N/P呈顯著正相關, 其中, 泥溫與春季甲藻拷貝數顯著相關, Ca和K顯著影響夏季甲藻拷貝數, 而TN和TC則分別是秋、 冬季甲藻拷貝數的主要影響因子．