茶葉中東莨菪素和東莨菪苷的測定及相關基因表達

曹紅利， 王浩乾， 何夢迪， 岳川，羅理勇， 曾亮， 郝心愿

1. 西南大學 食品科學學院，重慶 400715；2. 中國農業科學院茶葉研究所/農業農村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，杭州 310008

中國茶文化歷史悠久, 茶的消費量僅次于純水, 與可可和咖啡并稱為世界三大無酒精飲料[1-2]． 兒茶素、 咖啡堿和茶氨酸等是茶葉富含的特征性次生代謝產物, 是茶葉色、 香、 味等品質形成和飲茶保健功效發揮的物質基礎[3]． 茶樹次生代謝豐富, 目前已知的代謝物數量多達1 450種[4]; 對茶樹次生代謝物的深入研究有助于茶葉功能性成分的開發和茶樹資源的多元化利用．

東莨菪素是香豆素類化合物, 植物中主要以糖苷(東莨菪苷)的形式存在, 已知具有的藥理活性包括抗腫瘤、 防治高尿酸血癥、 降血壓、 降血脂、 解痙、 縮瞳和降低眼壓、 鎮痛等[5]． 目前已知東莨菪素在丁公藤、 枸杞、 桑樹、 華山參、 白鶴藤等傳統中藥植物中有較高的含量[6-11]． 其中, 丁公藤是東莨菪素的重要天然來源, 也是丁公藤發揮鎮痛、 抗炎、 祛痰、 平喘等藥理作用的主要生化成分[12-14]． 在煙草屬的植物葉片中, 東莨菪素和東莨菪苷還可以起到植保素的作用, 直接參與抵抗腐生性病原真菌的侵染[15]． 茶樹是包括香豆素類化合物在內的黃酮類物質積累豐富的代表物種, 但是截至目前有關茶樹中東莨菪素及其糖苷的含量和檢測方法的研究還鮮有報道．

香豆素類化合物廣泛存在于植物中． 模式植物擬南芥中發現東莨菪素、 東莨菪苷等香豆素類化合物主要在根中合成, 但是不同擬南芥材料中的含量存在顯著差異[16]． 已知東莨菪苷合成途徑是類黃酮代謝途徑的上游分支, 主要由4-香豆?；o酶A經香豆酸-3-羥化酶、 咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶和阿魏酰輔酶A-6’-羥化酶等催化形成(圖1), 但其合成的準確調控機制仍不清楚[17-18]． 低溫(10 ℃)條件下擬南芥的類黃酮代謝增強, 而在BEE1(BRASSINOSTEROID ENHANCED EXPRESSION1)和GRF(G2-LIKE FLAVONOID REGULATOR)突變體中包括東莨菪苷在內的香豆素類化合物合成顯著降低, 下游的花青素合成增強[18]． 因此BEE1和GRF基因可能是擬南芥中參與東莨菪苷生物合成的關鍵調控基因, 并受低溫影響． 倒春寒低溫條件下茶樹新梢差異基因表達譜分析表明, 東莨菪堿合成相關信號通路被顯著富集, 但茶樹中BEE1和GRF的同源基因的表達水平并無顯著差異[19]． 因此, 茶樹新梢中東莨菪苷的積累是否受低溫影響, 其積累代謝的主要影響因素和主要調控基因有待進一步研究．

本研究建立了茶葉中東莨菪素和東莨菪苷的HPLC檢測方法, 分析了茶樹不同發育階段、 不同環境條件和不同品種/品系茶葉中東莨菪素和東莨菪苷的質量分數, 檢測了茶樹東莨菪素和東莨菪苷生物合成途徑中相關基因的表達模式, 明確了東莨菪素和東莨菪苷積累的主要影響因素和相關基因的調控作用, 為茶葉中功能性成分的開發利用提供理論參考．

PAL: 苯丙氨酸解氨酶; C4H: 桂皮酸-4-羥化酶; C3H: 香豆酸-3-羥化酶; 4CL1: 對香豆酸輔酶A連接酶; CCoAOMT1: 咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶; F6’H1: 阿魏酰輔酶A-6’-羥化酶．圖1 東莨菪苷的生物合成途徑

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

以種植于中國農業科學院茶葉研究所試驗茶園的5年生“龍井43”盆栽茶樹為材料, 于春季萌動期移入人工氣候室(24 h光周期: 13 h光照/11 h黑暗, 白天24 ℃/夜晚20 ℃, 濕度70%), 待新梢萌發至魚葉期、 一芽一葉期、 一芽二葉期和一芽三葉期時取新梢用于東莨菪堿、 東莨菪苷質量分數測定和基因表達分析; 以選種圃種植的3～5年生的20個茶樹品種/單株為材料, 統一采摘秋季頂端第2～3片成熟葉進行東莨菪堿和東莨菪苷質量分數測定, 分析其在品種間的差異．

低溫脅迫試驗以正常生長條件下的“龍井43”盆栽茶樹為材料, 分別在新梢萌發至魚葉期、 一芽一葉期、 一芽二葉期和一芽三葉期時給予低溫處理(24 h光周期: 13 h光照/11 h黑暗, 白天4 ℃/夜晚2 ℃, 濕度70%), 于處理后24 h, 48 h取新梢用于質量分數檢測． 茶尺蠖為害試驗同樣以“龍井43”盆栽茶樹為材料, 于秋季茶樹停止生長前接種二齡茶尺蠖幼蟲, 每個處理枝條接種3頭, 于接種72 h后采集為害葉片． 所有樣品采集均設3個生物學重復, 采集樣品立即投入液氮中冷凍, 在-80 ℃低溫條件下保存備用．

1.2 東莨菪素與東莨菪苷質量分數檢測

1.2.1 色譜條件

利用ACQUITY UPLC系統(Waters, 美國)進行檢測． 色譜條件1: X Bridge C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 流動相為甲醇(B)-0.1%甲酸水溶液(A)梯度洗脫; 洗脫程序為0～10 min, 15%～34% B; 10 ～ 20 min, 34% B; 20～35 min, 34%～38% B; 檢測波長345 nm, 流速1 mL/min, 柱溫25 ℃, 進樣量10 μL． 色譜條件2: X Bridge C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 流動相為甲醇(B)-0.1%甲酸水溶液(A)梯度洗脫; 洗脫程序為0～5 min, 15%～25% B; 5～10 min, 25%～30% B; 10～15 min, 30%～33% B; 15～20 min, 33%～36% B; 20～25 min, 36%～40% B; 檢測波長345 nm, 流速1 mL/min, 柱溫25 ℃, 進樣量10 μL．

1.2.2 標準溶液的配制及標準曲線制作

準確稱取東莨菪苷(CAS: 531-44-2, PhytoLab)和東莨菪素(CAS: 92-61-5, PhytoLab)標準品2.000 mg分別置于10 mL離心管中, 加入4 mL色譜純甲醇超聲溶解, 配成500 μg/mL的標準品溶液． 取該標準品溶液, 用色譜純甲醇稀釋成為系列梯度濃度的溶液, 上機檢測, 根據峰面積大小和標準品濃度, 制作標準曲線．

1.2.3 樣品溶液的制備

將茶葉樣品置于冷凍干燥機48 h凍干后, 研磨成粉末, 準確稱取樣品0.200 0 g于10 mL離心管中, 加入純甲醇5 mL, 室溫浸提4 h后, 4 000 r/min離心8 min, 用注射器吸取上清液過0.45 μm有機濾膜后收集于2 mL進樣瓶中．

1.2.4 回收率試驗

準確稱取0.200 0 g樣品粉末于10 mL離心管中, 加入東莨菪苷50.0 μg和東莨菪素20.0 μg標準品, 按樣品溶液制備方法進行浸提并收集于進樣瓶中．

1.3 核酸提取及表達分析

1.3.1 總RNA的提取及cDNA的合成

茶樹總RNA按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(CAT# DP441, 天根生化科技有限公司, 北京)的操作說明進行提取, 用NanoDrop ND2000微量核酸蛋白測定儀測定RNA濃度, 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量, RNA質量檢測合格后, 參照PrimeScript?RT reagent Kit 反轉錄試劑盒(CAT# DRR037A, 寶生物工程有限公司, 大連)的說明書步驟, 將RNA反轉錄合成cDNA用于基因表達分析．

1.3.2 基因表達分析

從“龍井43”茶樹基因組中篩選出東莨菪苷的生物合成途徑中的關鍵酶編碼基因CsPAL1,CsPAL2,CsC4H,Cs4CL2-1,Cs4CL2-2,Cs4CL3和CsCCoAOMT1等[20], 根據基因cDNA序列的特異性, 利用Primer-Blast軟件設計目的基因的熒光定量PCR(qRT-PCR)引物(表1)． qRT-PCR反應體系為: SYBR Mix(Roche, Basel, Switzerland)5.0 μL, cDNA 1.0 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, 超純水3 μL, 總體系10 μL; 充分混勻, 短暫離心后, 在LightCycler 480 Ⅱ實時熒光定量PCR儀(羅氏, 美國)上進行PCR 擴增, 反應程序為95 ℃ 5 min, 95 ℃ 10 s, 56 ℃ 15 s, 12 ℃ 12 s, 45個循環后增加溶解曲線． 以茶樹基因CsPTB為內參基因[21], 每個反應3次生物學重復, 2次技術重復, 2-ΔCT或2-ΔΔCT法分析結果．

表1 茶樹東莨菪素和東莨菪堿合成相關基因實時熒光定量引物

2 結果與分析

2.1 標準曲線及回收率

前人通過采用甲醇為提取溶劑, 分別用345 nm[11], 346 nm[22-23], 347 nm[24]等波長來測定一匹綢、 參杞等植物中的東莨菪素和東莨菪苷． 本研究通過全波長掃描顯示, 在茶樹中東莨菪素和東莨菪苷的最大紫外吸收波長為345 nm, 因此把345 nm作為本研究的測定波長． 將配制好的梯度濃度標準品溶液按色譜條件1進樣, 分析色譜圖并記錄峰面積, 以峰面積為縱坐標、 以對照品濃度為橫坐標繪制標準曲線, 計算2種標準品的線性回歸方程． 東莨菪素回歸方程為y=32 520.966 20x-21 613.773 82,r=0.999 8, 在0.5～64 μg/mL濃度范圍內呈良好線性關系; 東莨菪苷回歸方程為y=17 984.273 65x-20 044.097 60,r=0.999 9, 在1～128 μg/mL濃度范圍內呈良好線性關系．

將配制好的梯度濃度標準品溶液按色譜條件2進樣, 分析色譜圖并記錄峰面積, 以峰面積為縱坐標、 以對照品濃度為橫坐標繪制標準曲線, 計算2種對照品的線性回歸方程． 東莨菪素回歸方程為y=33 803.743 801x-17 723.041 828,r=0.999 821, 在0.5～ 64 μg/mL濃度范圍內呈良好線性關系; 東莨菪苷回歸方程為y=18 669.680 731x-16 520.198 296,r=0.999 9, 在1～128 μg/mL濃度范圍內呈良好線性關系．

東莨菪苷平均回收率為91.7%, RSD=3.32%(n=5); 東莨菪素平均回收率為93.5%, RSD=2.64%(n=5)． 該結果與已報道的檢測方法的效率基本一致, 表明2種色譜條件均具有較好的測定準確度, 均能夠用于茶葉中東莨菪苷和東莨菪素的定量檢測(圖2)．

1為東莨菪苷; 2為東莨菪素．圖2 茶葉樣品的液相色譜

不同處理間小寫字母不同表示差異有統計學意義(p<0.05)．圖3 不同發育階段葉片中東莨菪素和東莨菪苷的質量分數

2.2 茶樹新梢中東莨菪素和東莨菪苷質量分數測定

通過比較2種色譜條件對茶樹新梢和成熟葉中東莨菪苷和東莨菪素的檢測效果, 發現利用色譜條件1對茶樹新梢進行檢測得到的效果更理想, 而茶樹成熟葉檢測需對梯度洗脫條件進行優化, 宜采用色譜條件2進行檢測． 本研究檢測了“龍井43”茶樹不同萌發階段新梢中的東莨菪苷和東莨菪素質量分數變化, 結果顯示, 在茶芽萌發不同階段的新梢中, 東莨菪素的質量分數顯著低于東莨菪苷的質量分數, 且東莨菪素質量分數在不同階段新梢中的質量分數變化差異無統計學意義, 從魚葉期到一芽三葉期的過程中, 東莨菪素的質量分數變化不明顯, 均維持在相同的水平; 而東莨菪苷的質量分數隨著新梢成熟度的增加其質量分數顯著升高, 在一芽二葉和一芽三葉期新梢中質量分數顯著高于魚葉期和一芽一葉期, 均達到200 μg/g以上(圖3)．

2.3 不同茶樹材料中東莨菪素和東莨菪苷的質量分數檢測

本研究選取包含中小葉種、 大葉種、 可可茶和葉色變異的茶樹品種或單株20個材料, 對這些材料中所含的東莨菪苷和東莨菪素的質量分數進行檢測． 結果顯示, 不同茶樹材料中東莨菪苷和東莨菪素的質量分數差異較大, 東莨菪苷質量分數分布范圍為25.84～80.76 μg/g, 而東莨菪素質量分數分布范圍為18.34～50.88 μg/g(表2)．

表2 不同茶樹材料中東莨菪素和東莨菪苷的質量分數

報道顯示, 丁公藤中東莨菪素和東莨菪苷的質量分數范圍分別為80～380 μg/g和150 ～ 1 040 μg/g[24], 寧夏枸杞中東莨菪素和東莨菪苷的質量分數分別為27.5～57.3 μg/g和59.5～167.6 μg/g[10], 一匹綢中東莨菪素和東莨菪苷的質量分數分別為38～240 μg/g和140～1 460 μg/g[22], 白花蛇舌草中東莨菪素的質量分數為6.5～17.8 μg/g[25]． 可以看出茶葉中東莨菪素和東莨菪苷的質量分數較白花蛇舌草、 枸杞高或相當, 而低于一匹綢和丁公藤． 總體上茶葉中的東莨菪苷的質量分數高于東莨菪素, 在檢測材料中僅在大葉種的2017M-49單株中東莨菪素的質量分數高于東莨菪苷． 本研究還發現黃化變異單株CT2016-2的東莨菪苷和東莨菪素的質量分數均較低; 紫色變異品種紫鵑中二者的總質量分數最高, 且主要是以東莨菪苷的形式存在, 其質量分數是東莨菪素的3.7倍; 白化品種安吉白茶中具有較高質量分數的東莨菪苷和相對較低的冬莨菪素．

2.4 東莨菪素和東莨菪苷在低溫脅迫和茶尺蠖為害下的質量分數變化

為了探究生物與非生物脅迫是否對茶葉中東莨菪素和東莨菪苷質量分數有影響, 本研究分析了其在低溫和茶尺蠖為害條件下茶樹材料中的質量分數． 以茶樹春季萌發至魚葉、 一芽一葉、 一芽二葉和一芽三葉期的組織為材料, 分別進行低溫脅迫處理, 并檢測處理48 h內的物質質量分數變化． 結果顯示, 在低溫脅迫下, 東莨菪素的質量分數在各個時期的材料中變化均無統計學意義; 在魚葉期低溫脅迫處理48 h時, 東莨菪苷質量分數顯著降低, 而在一芽一葉、 一芽二葉和一芽三葉中的質量分數變化均無統計學意義(圖4)． 在擬南芥中的研究表明, 東莨菪苷的生物合成受低溫影響[19], 這與本研究的結果不一致, 可能是由于物種間的差異以及茶葉中豐富的次生代謝物的影響． 茶尺蠖為害的樣品分析結果顯示, 茶葉在茶尺蠖為害后其體內的東莨菪素和東莨菪苷質量分數變化無統計學意義(圖5)．

不同處理間小寫字母不同表示差異有統計學意義(p<0.05)．圖4 新梢中東莨菪素和東莨菪苷在低溫脅迫下質量分數的變化

不同處理間小寫字母不同表示差異有統計學意義(p<0.05)．圖5 東莨菪素和東莨菪苷在茶尺蠖為害葉片中的質量分數變化

2.5 東莨菪苷合成相關基因在不同發育階段新梢中的表達模式分析

茶葉中東莨菪苷和東莨菪素的質量分數與新梢發育程度密切相關． 本研究基于“龍井43”的基因組數據, 篩選出茶葉中東莨菪苷生物合成通路中的關鍵基因CsPALs,CsC4H,Cs4CLs和CsCCoAOMT1等, 檢測這些基因在茶芽不同萌發階段新梢中的表達模式變化． 結果顯示, 這些基因在魚葉期新梢中的表達量相對較高, 隨著成熟度的增加,CsPAL1,Cs4CL2-2和Cs4CL3的表達量降低, 到一芽三葉期時如CsPAL2等基因的表達量也顯著降低, 而CsC4H,CsCCoAOMT1和Cs4CL2-1的表達在魚葉期到一芽三葉期中的變化無統計學意義(圖6)． 在新梢生長過程中, 整體上基因表達豐度與黃酮類生物合成高度相關, 但在合成通路中的上游基因CsPALs,CsC4H和Cs4CLs的表達豐度與兒茶素和黃酮醇糖苷的積累量存在較低的相關關系[26]． 這可能是由于次生代謝物質合成網絡復雜, 且下游產物合成底物可能來自多個代謝途徑, 導致上游基因表達水平與下游目標代謝物質量分數的高低不存在顯著的相關關系．

不同處理間小寫字母不同表示差異有統計學意義(p<0.05)．圖6 東莨菪素和東莨菪苷合成相關基因在不同發育階段葉片中的表達

3 結論

本研究建立了基于高效液相色譜測定茶葉中東莨菪素和東莨菪苷的方法, 并利用該方法分析了茶樹不同發育時期新梢(魚葉期到一芽三葉期)、 茶尺蠖為害和低溫等逆境脅迫處理下東莨菪素和東莨菪苷的質量分數變化, 結果顯示茶葉中東莨菪苷的質量分數顯著高于東莨菪素, 且東莨菪苷隨著成熟度的增加而顯著累積, 東莨菪素和東莨菪苷的質量分數受低溫和茶尺蠖脅迫的影響較?。?對20個不同茶樹品種/單株中的東莨菪素和東莨菪苷的質量分數進行檢測結果顯示, 不同茶樹材料間東莨菪素和東莨菪苷的質量分數差異較大, 茶葉中東莨菪素質量分數為18.34～50.88 μg/g, 東莨菪苷質量分數為25.84～80.76 μg/g, 與部分中藥材中的質量分數相近． 進一步對東莨菪苷生物合成相關的基因表達模式進行檢測結果表明, 合成通路上游基因的表達模式與東莨菪苷的積累模式間不存在顯著的相關關系． 總之, 由于茶葉中富含東莨菪素和東莨菪苷, 且具有重要的潛在保健功效, 能夠為茶葉功能性成分開發和茶樹資源多元化利用提供重要參考．