miR-26a-5p 影響肝癌細胞遷移和侵襲的機制研究

范巍巍 曹萌 魏清筠

在中國，肝癌是高發性惡性腫瘤，手術切除是目前臨床治療的主要手段，但術后5 年復發率高達40%～60%，嚴重威脅患者的生命健康[1]。肝癌的發生、發展是一個由多基因參與的、多步驟、多階段的由體內外多因素相互作用的復雜過程，涉及編碼和非編碼基因結構和表達水平的異常。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來研究較多的一類非編碼基因，異常表達的miRNA 可能在肝細胞癌變中發揮重要作用，與肝癌轉移復發、預后和治療等緊密相關[2-4]。Li 等[5]發現，miR-26a-5p 在腫瘤組織和細胞中均異常低表達，過表達miR-26a-5p 可有效抑制腫瘤細胞的增殖生長。Ji 等[6]發現，肝癌患者miR-26-5p 的表達水平與IL-6 的表達呈負相關，而IL-6 可通過多條信號通路直接或間接影響腫瘤進程，提示miR-26a-5p 可能通過影響IL-6 相關的信號傳導途徑對肝癌的發生、發展起調控作用。本研究檢測miR-26a-5p 和IL-6 在多種肝細胞中的表達情況，分析過表達miR-26a-5p 對肝轉移性腺癌細胞SK-HEP-1 轉移和侵襲能力的影響，驗證miR-26a-5p與IL-6 基因的靶向作用關系，探討其可能的分子機制，以期為肝癌復發、轉移提供有價值的分子診斷標志物。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑

1.1.1 實驗細胞及培養 人肝細胞株LO2，人肝癌細胞株HepG2、BEL-7402、SMMC-7721，高轉移性肝癌細胞株MHCC97H，肝轉移性腺癌細胞株SK-HEP-1，均購自富衡生物科技（上海）有限公司。所有細胞均培養于37 ℃，含5%二氧化碳（CO2）的細胞培養箱內，使用含10% FBS、100 U/ml 青霉素及100 U/ml 鏈霉素的高糖（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養基。0.25%胰酶消化傳代，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態。所有實驗均在江蘇省中醫藥研究院完成。

1.1.2 主要試劑 miR-26a-5p 模擬物和模擬物對照購自中國百奧邁科生物技術有限公司，批號分別為BH0930 和BIO82201。Transwell 小室（批號：2144016）購自美國Millipore 公司，Matrigel 基質膠（批號：356237）購自美國Corning 公司。pMIR-REPORT ?miRNA 表達報告基因載體系統（批號：AM5795）購自美國ThermoFisher 公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號：E1910）購自美國普洛麥格生物技術有限公司。Trizol 提取試劑（批號：15596018）購自美國ThermoFisher 公司。MiPure 細胞miRNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑和SYBR Green 實時熒光定量PCR 試劑盒均購自中國諾唯贊生物科技股份有限公司，批號分別為RC201、R323-01、Q712-02。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（批號：P0010）購自中國碧云天生物技術有限公司。信號轉導和轉錄激活因3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）抗體、磷酸化STAT3（phospho- STAT3，p-STAT3）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購自美國CST 公司，批號分別為4904T、9145T、5741S、3195T、5174T。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗（批號：20000626）購自Proteintech 公司。IL-6 ELISA 試劑盒（批號：100802）購自美國R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 6 種細胞miR-26a-5p 表達的檢測 采用實時熒光定量PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）法。使用miRNA 提取試劑盒提取細胞總miRNA，采用莖環法逆轉錄合成cDNA，根據SYBR Green qRT-PCR 試劑盒說明書方法檢測細胞miR-26a-5p 相對表達量，以U6 作為內參。miR-26a-5p 引物序列：逆轉錄CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCCTATC，F-5'-ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAATCCAGGA-3'，R-5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6 引物序列：F-5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R-5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.2 6 種細胞IL-6 mRNA 表達的檢測 使用Trizol試劑提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書方法逆轉錄合成cDNA。根據SYBR Green qRT-PCR 試劑盒說明書方法檢測細胞中IL-6 mRNA 的相對表達量，以GAPDH為內參。采用2-ΔΔCt法計算IL-6 mRNA相對表達量。IL-6 mRNA引物序列：F-5'-GGCACTGGCAGAAAACAACC- 3'，R- 5'- GCAAGTCTCCTCATTGAATCC- 3'；GAPDH 引物序列：F-5'-TCAGTGGTGGACCTGACCTG-3'，R-5'-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3'。

1.2.3 細胞轉染 以1.2.1 中miR-26a-5p 表達水平最高的細胞株作為轉染細胞。取對數生長期細胞調整密度至1.5～2.0×105/孔，接種于6 孔板中培養過夜。待細胞達到50%融合度時，將培養基更換為不含雙抗的DMEM 培養基。使用miR-26a-5p模擬物和模擬物對照分別轉染細胞，分為miR-26a-5p 模擬物組和模擬物對照組；以轉染空脂質體組細胞為空白對照組，共3 組。轉染4～6 h 后，將培養基更換為含10%FBS 的DMEM 培養基，37 ℃繼續培養48 h，用于后續實驗。

1.2.4 轉染細胞中IL-6 表達的檢測 采用ELISA 法。1.2.3 中各組細胞培養72 h 后，收集細胞培養液上清液，稀釋后加入酶標板中。根據ELISA 試劑盒說明書方法，測定450 nm 時的光密度，以空白顯色孔為對照，根據標準品所測的結果，繪制“吸光值-濃度”曲線，計算3 組細胞培養液上清液中IL-6 質量濃度。

1.2.5 轉染細胞熒光素酶活性的檢測 采用雙熒光素酶報告實驗。通過工具網站TargetScan 預測分析miR-26a-5p 與IL-6 的堿基結合位點。將野生型（Wt）的IL-6 3'-非編碼區（untranslated region，UTR）的序列擴增到pMIR-Report 熒光素酶載體系統的下游位點，引物序列：F- 5'- CTATATTTTTAAGAAGTACCACTTGAAACATTTA- 3'，R- 5'- AGCTTAAATGTTTCAAGTGGTACTTCTTAAAAATATAGAGC-T-3'，構建熒光素報告基因質粒。設計定點突變引物，將結合位點中種子序列TT突變為AA，引物序列：F-5'-CTATATTTTTAAGAAGTACCACAAGAAACATTTA- 3'，R- 5'- AGCTTAAATGTTTCTTGTGGTACTTCTTAAAAATATAGAGCT- 3'，構建靶點突變型（Mut）報告基因質粒。將轉染細胞以2.0×104/孔的密度接種于24 孔板中，實驗分為6 組：miR-26a-5p 模擬物組、模擬物對照組、空白對照組、miR-26a-5p 模擬物+空載質粒組、miR-26a-5p 模擬物+ Wt 質粒組、miR-26a-5p 模擬物+ Mut 質粒組。共轉染48 h 后，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒方法裂解細胞，檢測并計算細胞熒光素酶相對活性。

1.2.6 轉染細胞遷移能力的檢測 采用細胞劃痕實驗。將1.2.3 中3 組細胞調整密度至2×105/ml 接種于6 孔板中，待細胞達到50%融合度時，用無菌槍頭在單層細胞上直線劃痕，PBS 清洗，分別于0 和48 h 時倒置顯微鏡觀察并拍照。重復3 次實驗，每次2 個復孔。對拍照視野中遷移過原劃線的細胞進行計數，用Image J 軟件測量兩側細胞的間距。

1.2.7 轉染細胞侵襲能力的檢測 采用Transwell 法。在24 孔Transwell（膜孔徑8 mm）的上室加入1 g/L 的基質膠70 μl，37 ℃放置60 min 后形成基底膜結構。取1.2.3 中3 組細胞，以無血清培養基將細胞密度調整為1×105/ml，取200 μL 細胞懸液接種于上室，下室加入含10% FBS 的DMEM 培養基500 μl，37 ℃，5% CO2培養24 h 后，棉簽抹去濾膜上層細胞，甲醇固定。結晶紫染色15 min。重復3 次實驗，光鏡觀察拍照，計數穿過膜的細胞數。

1.2.8 轉染細胞上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關蛋白表達的檢測 采用Western blot法。收集1.2.3各組細胞，裂解后，4 ℃12 000 r/min 離心15 min 收集總蛋白。根據BCA 試劑盒方法測定蛋白含量，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），濕法轉膜，5%脫脂牛奶封閉后，加入STAT3、p-STAT3、E-cadherin、Vimentin、GAPDH 等一抗，4 ℃孵育過夜；PBS 溶液洗膜3 次，加入HRP 二抗，室溫孵育1 h。采用化學發光法，滴加ECL 顯影液進行熒光顯影，拍照保存。以鼠GAPDH 單抗作為內參，使用Image J圖像處理軟件分析目的條帶的灰度值，計算目的蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/GAPDH 灰度值。

1.2.9 EMT 相關基因mRNA 表達的檢測 采用qRTPCR 法。收集1.2.3 各組細胞，參照1.2.2 方法提取總RNA，并逆轉錄成cDNA，qRT-PCR 法擴增mRNA。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算相關基因mRNA 相對表達量。E-cadherin 蛋白的編碼基因CDH1 引物序列：F-5'-GCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAG-3'，R-5'-TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG-3'；N-cadherin 蛋白的編碼基因CDH2 引物序列：F-5'-CCTCCAGAGTTTACTGCCATGAC-3'，R-5'- GTAGGATCTCCGCCACTGATTC-3'；Snail 蛋白的編碼基因SNAI1 引物序列：F-5'-TGCCCTCAAGATGCACATCCGA-3'，R-5'-GGGACAGGAGAAGGGCTTCTC-3'；Slug 蛋白的編碼基因SNAI2引物序列：F-5'-ATCTGCGGCAAGGCGTTTTCCA-3'，R-5'-GAGCCCTCAGATTTGACCTGTC-3'。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0 統計軟件，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 6 種細胞miR-26a-5p 和IL-6 mRNA 相對表達量的比較 相比LO2，BEL-7402、SMMC-7721、MHCC97H和SK-HEP-1 細胞中miR-26a-5p相對表達量均顯著降低（均P＜0.05），其中SK-HEP-1 細胞中miR-26a-5p 相對表達量最低，見圖1A。相比LO2，BEL-7402、SMMC-7721 和SK-HEP-1 細胞中IL-6 mRNA 相對表達量顯著升高（P＜0.05），其中SK-HEP-1 細胞的IL-6 相對表達量最高，見圖1B。因此后續實驗以SK-HEP-1作為研究對象。

圖1 6 組細胞miR-26a-5p 和IL-6 mRNA 相對表達量的比較（A：miR-26a-5p；B：IL-6）

2.2 3 組轉染細胞中miR-26a-5p 和IL-6 表達的比較與模擬物對照組比較，miR-26a-5p 模擬物組細胞中miR-26a-5p相對表達量顯著升高（P＜0.01），可用于后續功能試驗分析；miR-26a-5p 模擬物組IL-6 mRNA 和蛋白相對表達量均顯著降低（均P＜0.05）?？瞻讓φ战M和模擬物對照組miR-26a-5p、IL-6 mRNA 和蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖2。

圖2 轉染細胞中miR-26a-5p和IL-6表達的比較（A：miR-26a-5p相對表達量；B：IL-6 mRNA 相對表達量；C：IL-6蛋白相對表達量）

2.3 轉染miR-26a-5p 細胞熒光素酶活性的比較TargetScan 預測發現，IL-6 mRNA 的3'-UTR 存在miR-26a-5p 高度保守的靶向結合位點，見圖3A。與模擬物對照組比較，miR-26a-5p 模擬物組IL-6 3'-UTR 熒光素酶相對活性顯著降低（P＜0.05）；空白對照組和模擬物對照組熒光素酶相對活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與miR-26a-5p 模擬物+Mut 質粒組比較，miR-26a-5p 模擬物+Wt 質粒組IL-6 3'-UTR 熒光素酶相對活性顯著降低（P＜0.05）；miR-26a-5p 模擬物+Mut 質粒組和miR-26a-5p 模擬物+空載質粒組比較，熒光素酶相對活性差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3B。說明miR-26a-5p 與靶基因IL-6 mRNA 3'-UTR 的結合作用是序列特異的。

圖3 miR-26a-5p 與IL-6 mRNA 3'-UTR 的靶向結合關系（A：Wt 和Mut IL-6 3'-UTR 與IL-6 mRNA 的潛在結合位點示意圖；B：6 組細胞熒光素酶相對活性的比較）

2.4 3 組轉染細胞遷移能力的比較 相比空白對照組和模擬物對照組，miR-26a-5p 模擬物組細胞遷移數量顯著降低（P＜0.01），細胞間劃痕的距離顯著增大（P＜0.01），見圖4。提示miR-26a-5p 抑制細胞遷移。2.5 3 組轉染細胞侵襲能力的比較 與模擬物對照組比較，miR-26a-5p 模擬物組細胞侵襲數顯著減少（P＜0.01）；空白對照組和模擬物對照組細胞侵襲能力比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖4 miR-26a-5p 對細胞遷移的影響（A：劃痕實驗檢測48 h 后3 組細胞遷移情況，×40；B：3 組細胞遷移數量比較；C：3 組細胞間劃痕距離比較）

圖5 miR-26a-5p 對細胞侵襲的影響（A：Transwell 實驗檢測3 組細胞的侵襲能力，×100；B：3 組細胞侵襲數比較）

2.6 3 組細胞STAT3 蛋白磷酸化水平和EMT 相關蛋白表達的比較 與模擬物對照組相比，miR-26a-5p 模擬物組p-STAT3/STAT3 表達水平顯著降低（P＜0.01），模擬物對照組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示STAT3 蛋白水平基本不變，但p-STAT3蛋白水平降低，見圖6A-B。與模擬物對照組相比，miR-26a-5p 模擬物組E-cadherin 表達水平顯著增加，Vimentin 表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖6C-D。

圖6 miR-26a-5p 對細胞STAT3 蛋白磷酸化及EMT 相關蛋白表達的影響（A：3 組細胞STAT3 和p-STAT3 蛋白電泳圖；B：3 組細胞STAT3 和p-STAT3 蛋白相對表達量比較；C：3 組細胞E-cadherin 和Vimentin 蛋白電泳圖；D：3 組細胞E-cadherin 和Vimentin 蛋白相對表達量比較）

2.7 3 組細胞EMT 相關基因mRNA 表達的比較 與模擬物對照組相比，miR-26a-5p 模擬物組細胞中CDH1 mRNA 表達水平顯著升高，CDH2、SNAI1、SNAI2 mRNA表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖7。

圖7 3 組細胞EMT 相關基因mRNA 表達的比較

3 討論

miR-26a-5p 全長22 nt，其表達失調與多種腫瘤演進過程有關[4-5]。研究發現，肝癌組織的miR-26a-5p 表達顯著低于癌旁肝組織，且低表達的患者預后較差，總生存率低[6]。miR-26a-5p 在肝癌組織和細胞中均異常低表達，過表達miR-26a-5p 可有效抑制肝癌細胞的增殖和遷移[7-10]。miR-26a-5p 的下調與肝癌患者腫瘤復發、轉移和預后不良顯著相關。Yang 等[11]發現，肝癌患者miR-26a-5p 表達水平與IL-6 表達呈負相關；聯合檢測miR-26a-5p 和IL-6 可作為判斷總生存期的獨立預后指標。TargetScan 預測發現，IL-6 mRNA 的3'-UTR 是高度保守的miR-26a-5p 的靶向區。推測miR-26a-5p 可能通過參與IL-6 相關的信號傳導途徑對肝癌的發生、發展起調控作用[12-13]。

Trohatou 等[9]在體外培養HepG2 細胞時加入IL-6，結果發現原癌基因（v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，c-Myc）激活，miR-26a-5p 的表達被抑制。與錢建升等[14]和Ma 等[15]發現的過表達miR-26a-5p 可抑制HepG2 和SMMC-7721 的增殖和遷移的結果一致。但要注意的是，不同肝癌細胞中miR-26a-5p 和IL-6 的表達水平不同[16]。本研究檢測并比較了miR-26a-5p 和IL-6 mRNA 在正常人肝細胞和人肝癌細胞系中的表達情況，結果發現HepG2 中miR-26a-5p高表達，IL-6 mRNA 幾乎不表達，而SK-HEP-1 剛好相反。使用化學合成miR-26a-5p 模擬物轉染SK-HEP-1，結果發現胞內miR-26a-5p 相對表達量顯著升高，IL-6 mRNA 相對表達量顯著降低，IL-6 蛋白相對表達量也相應降低。雙熒光素酶報告基因實驗證實了miR-26a-5p 與IL-6 mRNA 3'-UTR 存在靶向關系，且兩者結合存在序列特異性。劃痕實驗和Transwell 實驗進一步證實，過表達miR-26a-5p 能顯著抑制肝癌細胞遷移和侵襲。

IL-6 是腫瘤微環境中一種含量豐富的多能性細胞因子，通過Janus 激酶（Janus-activated kinase，JAK）/STAT 和NF-κB 等信號通路對腫瘤發生、發展產生直接或間接作用[17-20]。IL-6 信號激活會引起JAK 磷酸化，并誘導下游關鍵信號STAT3 磷酸化，活化的STAT3形成二聚體轉移入核，激活調控基因的轉錄活性，從而發揮生物學效應[21]。研究發現，大多數肝細胞癌患者體內IL-6/STAT3 信號異常激活[22-23]。IL-6/STAT3 信號不僅對原發性肝癌有影響，還會通過形成促轉移生態位造成腫瘤轉移，導致繼發性肝癌[24]。故STAT3 被認為是介導IL-6 功能的最主要轉錄因子。EMT 是上皮細胞去分化轉化為間充質表型的生物學過程，被普遍認為參與了肝癌的早期轉移進程[25-26]。EMT 發生時，上皮細胞分子標志物E-cadherin 表達降低，間質細胞分子標志物Vimentin 表達增加[27]。Zhang 等[28]在人肝癌細胞株SMMC-7721 和MHCC97H 中過表達STAT3，結果發現E-cadherin 表達顯著下調，Vimentin 表達顯著上調，進一步STAT3 信號傳導通路在肝癌侵襲和轉移過程中起重要作用[29-30]。

本研究在高轉移肝癌細胞SK-HEP-1 中過表達miR-26a-5p，結果發現肝癌細胞遷移和侵襲被有效抑制，其可能機制是通過靶向抑制IL-6 mRNA，下調STAT3 磷酸化，升高上皮標志E-cadherin 表達和降低間質標志Vimentin 表達。即過表達miR-26a-5p 通過IL-6/STAT3 軸抑制肝癌細胞的遷移和侵襲，可能是治療肝癌轉移的潛在策略。