低氧環境下甲狀腺乳頭狀癌細胞中期因子表達的調節機制研究

李吉 張建輝 謝中意 李君強

在中國，甲狀腺癌確診患者每年新增約20%。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的甲狀腺癌類型，占所有甲狀腺癌病例的75%～85%[1]，多發于女性，好發于20～55 歲年齡段。多數PTC進展緩慢，患者預后良好，但仍有少數患者出現淋巴結轉移甚至血道傳播[2]。某些特定基因如鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1 V600E 突變[3]、缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）1-α 的異常激活等，可誘導PTC 發生且導致患者預后惡化[4]，因此明確腫瘤相關基因及其作用機制可為PTC 診療、預后評估提供有價值的信息。研究發現，HIF1-α 不僅能夠誘導ABC轉運蛋白等蛋白將化療藥物排出細胞，介導產生耐藥性[5]，且能夠激活CD10、半乳糖凝集素3（galectin-3，gal3）等效應分子，進一步調節PTC 細胞系的增殖和能量代謝途徑等[5-6]。低氧環境下腫瘤細胞能夠分泌各種細胞因子，其中中期因子（Midkine）可誘發腫瘤微環境中的免疫抑制信號，增強癌細胞的血管生成和增殖活性[7]，但具體調節機制仍有待明確。本研究旨在探討低氧環境下PTC 細胞中CD10、gal3 等蛋白的表達情況和相應的分子生物學意義，闡述其對Midkine 表達的調節機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及培養條件 人PTC 細胞系BCPAP 與TPC1 購于國家實驗細胞資源共享服務平臺，接種至含10%FBS 的DMEM 培養基。正常培養條件為37 ℃、5%氧氣（O2）、5%二氧化碳（CO2）。缺氧培養條件為37 ℃、1%O2、5%CO2。

1.1.2 主要試劑 lipofectamine 2000 轉染試劑盒（批號：11668030）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（批號：23225）購自美國ThermoFisher公司；HIF1-α、CD10、gal3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（批號分別為ab179483、ab256494、ab209344 和ab9485）均購自美國abcam 公司；兔抗辣根過氧化物酶、鼠抗辣根過氧化物酶（批號為A0208 和A0216）購自上海碧云天生物技術有限公司；雙熒光素報告酶試劑盒（批號：E1910）購自美國Promega 公司；ELISA 檢測試劑盒（批號：EH319RB）購自美國invitrogen 公司。HIF1-α小發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列為5'-GAAACTCTTCCAAGCAATTTT-3'、CD-10 的編碼基因膜金屬肽內切酶（membrane metalloendopeptidase endonuclide，MME）shRNA 序列為5'- CTAAGGTCTATCAAGTCAATC-3'、gal3 的編碼基因人可溶性半乳糖凝集素3（lectin galactoside binding soluble-3，LGALS3）shRNA 序列為5'-TGCCTCGCATGCTGATAACAA-3'，均由美國sigma 公司合成；HIF1-α cDNA、CD10 cDNA、gal3 cDNA、CD10 啟動子、gal3 啟動子均由華大基因公司合成。二甲基乙二酰氨基乙酸（dimethyloxallyl glycine，DMOG）購自美國selleckchem 公司，批號：S7483。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國sigma 公司，批號：67-68-5。

1.2 方法

1.2.1 不同培養條件下細胞HIF1-α、CD10 與gal3 蛋白表達的檢測 采用Western blot 法。取BCPAP 和TPC1 分為常氧組與缺氧組，常氧組正常培養，缺氧組缺氧培養。兩組細胞均培養24 h 后使用RIPA 裂解液冰上裂解30 min，根據BCA 蛋白定量試劑盒方法檢測總蛋白；將蛋白轉至PVDF 膜上，并使用5% BSA 室溫封閉1 h，4 ℃過夜；標記相應的一抗，抗體稀釋比例均為1∶1 000；室溫孵育30 min 后標記相應的二抗，稀釋比例為1∶5 000；使用ECL 發光液檢測蛋白灰度值。以GAPDH 為對照，檢測細胞中HIF1-α、CD10、gal3 蛋白相對表達量。

1.2.2 DMOG 對缺氧組細胞HIF1-α、CD10 與gal3 表達的影響 取缺氧培養的BCPAP 和TPC1 分為DMOG 組和對照組，DMOG 組加入5 μl/孔1 mmol/L DMOG，對照組每孔使用等體積DMSO，培養24 h。參照1.2.1 采用Western blot 法計算兩組細胞HIF1-α、CD10、gal3 蛋白相對表達量。

1.2.3 不同缺氧時間下細胞HIF1-α、CD10 與gal3 蛋白表達的檢測 BCPAP 和TPC1 細胞分別在低氧環境下培養0、2、4、6、12 與24 h。取出細胞，參照1.2.1 采用Western blot 法計算各組HIF1-α、CD10、gal3 蛋白相對表達量。

1.2.4 轉染HIF1-α shRNA 對CD10 與gal3 蛋白表達的影響 取正常培養的BCPAP 和TPC1，各分為實驗組和對照組，實驗組轉染HIF1-α shRNA，對照組轉染HIF1-α shRNA 的亂碼序列，培養48 h。參照1.2.1 采用Western blot 法檢測各組細胞中HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白相對表達量。

1.2.5 HIF1-α 與CD10、gal3 靶向性預測及驗證 取正常培養的BCPAP 和TPC1 細胞各分為4 組。MME 沉默實驗中，空白組轉染不含啟動子序列的空載質粒，對照組轉染攜CD10 啟動子質粒，HIF1-α 組共轉染攜CD10 啟動子和HIF1-α cDNA 質粒，實驗組共轉染攜CD10 啟動子和CD10 cDNA 質粒。LAGLS3 沉默實驗中，空白組轉染不含啟動子序列的空載質粒，對照組轉染攜gal3 啟動子質粒，HIF1-α 組共轉染攜gal3啟動子和HIF1-α cDNA 質粒，實驗組共轉染攜gal3啟動子和gal3 cDNA 質粒。各組細胞均培養48 h。采用雙熒光素報告酶法。取各組細胞用PBS 清洗2 次，加入裂解緩沖液常溫搖床震蕩裂解15 min；依次加入加入熒光素報告酶反應液Ⅱ和stop&glo 液，測定各質粒熒光值，進行HIF1-α 與CD10、gal3 的靶向性驗證。

1.2.6 基因相關性分析 使用GEOmetadb 包完成GEO數據庫的檢索，確定備選數據集為GSE60542（n=92），使用GEOquery 包下載該數據集，經log2 轉換進行標準化處理；使用cor.test（）函數計算HIF1-α 和MME、LGALS3 之間的Pearson 相關系數，并使用plot（）函數繪制散點圖。

1.2.7 轉染細胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達的檢測 取正常培養的BCPAP 和TPC1 各分為4 組，對照組轉染空載體，MME 敲低組轉染攜MME shRNA 質粒，LGALS3 敲低組轉染攜LGALS3 shRNA 質粒，實驗組共轉染MME shRNA 和LGALS3 shRNA 質粒，低氧條件下培養48 h。采用Western blot 法檢測各組細胞中HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白相對表達量。

1.2.8 不同缺氧時間和轉染細胞Midkine 表達的檢測 采用ELISA 法。BCPAP 和TPC1 細胞分別在低氧環境下培養0、2、4、6、12 與24 h。1.2.7 中各組細胞培養48 h。取細胞上清液500 μl，4℃、6 000 r/min 離心5～10 min ，取上清液。參照ELISA 檢測試劑盒說明書方法，使用酶標儀檢測450 nm 下的吸光度。根據標準曲線計算上清液Midkine 水平。

1.3 統計學處理 使用R（4.0.5）統計軟件。計量資料兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。使用Pearson 相關分析計算基因間的關聯性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同培養條件下細胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達的比較 相比常氧組，缺氧組細胞HIF1-α、CD10與gal3 蛋白相對表達量均顯著上升，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖1A。相比對照組，DMOG 組HIF1-α、CD10 與gal3 蛋白表達水平也顯著上升，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖1B。

圖1 不同培養條件下細胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達的比較（A：缺氧對蛋白表達的影響；B：DMOG 對蛋白表達的影響）

2.2 不同缺氧時間下細胞HIF1-α、CD10 與gal3 蛋白表達的變化 細胞中HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達總量呈現時間依賴性，均隨著低氧誘導時間增加而增加，見圖2。

圖2 不同缺氧時間下細胞HIF1-α、CD10與gal3蛋白表達總量的變化（A：BCPAP；B：TPC1）

2.3 轉染HIF1-α shRNA 細胞CD10 和gal3 蛋白表達的比較 相比對照組，實驗組細胞中CD10 和gal3 蛋白相對表達量均顯著降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖3。

圖3 轉染HIF1-α shRNA 細胞CD10 與gal3 蛋白表達的比較（A：蛋白電泳圖；B：CD10、gal3 蛋白表達的比較）

2.4 HIF1-α 與CD10、gal3 的靶向性檢測 相比空白組，其他各組熒光素酶相對活性均顯著提高（均P＜0.01）；提示HIF1-α cDNA 可通過直接與CD10 和gal3啟動子結合增強兩者的轉錄表達，見圖4。

圖4 HIF1-α 與CD10、gal3 的靶向性檢測（A：BCPAP；B：TPC1）

2.5 HIF1-α 與MME、LGALS3 mRNA 的相關性分析在mRNA 水平上可觀察到HIF1-α 與MME 和LGALS3表達的相關系數分別為0.43 和0.58，均呈正相關（均P＜0.01），見圖5。

圖5 基因相關性分析（A：HIF1-α 與LGALS3 mRNA 表達的相關性；B：HIF1-α 與MME mRNA 表達的相關性）

2.6 轉染細胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達的比較 相比對照組，MME 敲低組CD10 蛋白相對表達量顯著下降，LGALS3 敲低組gal3 蛋白相對表達量顯著下降，實驗組CD10 和gal3 蛋白相對表達量均顯著下降，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖6。

圖6 轉染細胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達的比較（A：BCPAP 蛋白電泳圖；B：各組BCPAP 中蛋白表達的比較；C：TPC1 蛋白電泳圖；D：各組TPC1 中蛋白表達的比較）

2.7 不同缺氧時間和轉染細胞Midkine 表達的比較隨缺氧時間延長，細胞中Midkine 表達水平升高，見圖7A。低氧培養48 h 后，MME 敲低組、LGALS3 敲低組細胞中Midkine 表達水平相比對照組顯著降低，實驗組Midkine 表達水平進一步下降，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖7B。

圖7 不同缺氧時間和轉染細胞中Midkine 表達水平的比較（A：不同缺氧時間下細胞Midkine 表達水平；B；不同轉染細胞Midkine表達水平）

3 討論

臨床發現絕大多數實體腫瘤呈現缺氧微環境，在實體腫瘤中，缺氧環境主要表現為脈管系統70～150 μm范圍內O2由于腫瘤增殖而被快速消耗，因此腫瘤組織中的缺氧與內部異常的血管增生、腫瘤細胞對O2需求的大幅增加高度相關[8]。缺氧帶來的影響主要為糖酵解途徑的改變，包括HIF1-α、葡萄糖轉運蛋白1（glucose transporter-1，GLUT-1）、磷酸葡萄糖異構酶表達、磷酸甘油酸激酶1 等糖酵解途徑酶表達的異常，從而誘導腫瘤細胞出現高糖酵解率，在這一過程中HIF1-α發揮著至關重要的作用。HIF1-α 廣泛參與PTC 中的多條關鍵信號通路，如通過誘導血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）促進血管生成[9]，通過GLUT-1 介導腫瘤細胞的厭氧代謝[10]，通過碳酸酐酶IX（Carbonic anhydrase IX，CA-9）調節細胞內pH[11]，通過p21、p27 等蛋白調節細胞周期[12]。近年來，HIF1-α 對細胞外基質的重塑以及對細胞遷移能力的調節日趨成為研究熱點，低氧環境下腫瘤細胞能夠通過調節特定蛋白如基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、MMP-9 的表達[13]，或是特定細胞因子如Midkine 的表達來激活免疫抑制信號，阻斷免疫微環境中CD8+、M1 巨噬細胞等效應性免疫細胞的浸潤，進而誘發“冷腫瘤”的形成，嚴重削弱抑癌藥物作用[14]。因此明確低氧環境下腫瘤細胞的關鍵效應分子，對尋找腫瘤發生、發展過程的潛在診療靶點十分必要。

DMOG 是具有細胞滲透和競爭性的脯氨酰羥化酶抑制劑，可導致HIF1-α 的積聚和穩定，本研究使用缺氧與DMOG 模擬缺氧相結合培養細胞，結果發現BCPAP 與TPC1 細胞系受DMOG 刺激后，gal3、CD10 的表達均顯著上升，且對低氧環境呈現時間依賴性。在PTC 患者中，gal3 與Midkine 表達相關，且與患者預后、腫瘤轉移密切相關[15]。Midkine 是一種肝素結合生長因子，最初由于在小鼠胚胎發生過程中高度表達而受到關注[16]，作為一種在腫瘤中大幅上升的可溶性分泌蛋白，Midkine 不僅可通過肉瘤家族基因（sarcoma family of genes，Src）/有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）/ 磷脂肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路影響腫瘤細胞的增殖，缺氧狀態下，Midkine 還可與HIF1-α 結合介導缺氧狀態下的血管生成[17-18]。已有報道表明CD10廣泛參與免疫抑制因子如IL-6、IL-8 的分泌[19-20]，在大多數惡性腫瘤中CD10 表達上調，且與腫瘤分期呈現正相關[21]，腫瘤微環境中的缺氧條件被認為是CD10表達上調的關鍵原因之一[22]。gal3 是一種結構獨特的糖蛋白，廣泛參與纖維化、炎癥、癌癥等多種疾病背景，在細胞表面的免疫突觸中結合T 細胞抗原受體，抑制T 細胞的早期激活[23-24]，而在細胞內gal3 可通過結合B 細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）結合抑制細胞凋亡[25]，但尚無相關研究證實CD10 與Midkine 之間的關聯。本研究雙熒光素報告酶實驗證實HIF1-α 可結合到CD10 與gal3 的啟動子上，并直接調節CD10 與gal3 的轉錄水平，檢測CD10、gal3敲低細胞系中Midkine 表達量變化可知，隨著CD10、gal3 的表達沉默，Midkine 的表達亦顯著下降，表明CD10、gal3 可在低氧環境下，誘導PTC 細胞系中Midkine 的表達。即在低氧環境中，HIF1-α 可通過直接調控CD10、gal3 表達進而調節Midkine 的表達[26]。但小分子抑制劑或抗體阻斷HIF1-α 誘導的CD10、gal3的表達，及Midkine 的表達抑制以及相應的細胞功能變化等，還有待進一步研究。

綜上所述，本研究發現HIF1-α 可通過調控CD10、gal3 影響Midkine 表達，為進一步的診療靶點開發構筑了生物學基礎。