基于網絡藥理學探討黃芪抗阿霉素心肌細胞毒性的作用機制

侯宇芯，任晉宏，姚紅，馬慧萊，薛慧清

（山西中醫藥大學 基于炎性反應的重大疾病創新藥物山西省重點實驗室，山西 晉中 030619）

0 引言

阿霉素（Doxorubicin，DOX）屬于蒽醌類抗生素，臨床上多用于治療惡性腫瘤，然而高心臟毒性嚴重限制了其臨床應用［1］。臨床預防控制心臟毒性的途徑主要是通過使用心臟保護劑、控制化療藥物劑量等方式，存在效果差、影響化療療效等不足，在治療時采用中醫的整體辯證觀念對患者進行診治能夠取得較好的療效，有效降低心臟毒性［2］。經過幾十年的研究，阿霉素導致不可逆心臟毒性的主要因素被認為是造成心肌細胞凋亡和壞死［3-5］。

中醫證候研究表明腫瘤化療藥物在祛除病邪的同時導致氣血虛弱，機體狀況進入惡性循環［6］。黃芪（AstragaliRadix）為補藥之長，是血中之氣藥，補氣生血，補氣行血，療諸臟之虛［7］。研究表明，黃芪水煎劑可以抑制神經內分泌激素CGRP、ANP、CNP、NPY 的分泌，改善心功能容量指標，增加心臟射血能力［8］。賀智慧等研究表明黃芪注射液可以減少大鼠左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、左心室收縮末期內徑（left ventricular end systolic dimension，LVESD），增加左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF），減少內質網應激伴侶蛋白Grp78、ATF-4 及CHOP 表達，增多縫隙連接蛋白Cx43 表達，減少p-Cx43 表達，改善心肌病理及超微結構，減少心肌細胞凋亡［9］。但目前尚不明確黃芪抗阿霉素心肌細胞毒性的有效成分和分子機制。

本研究利用基因表達數據庫，以“doxorubicin cardiotoxicity”為關鍵詞，獲取GSE79413 與GSE157282 基因芯片數據，應用R 4.1.0 篩選差異表達基因（DEGs）；借助中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）篩選黃芪活性化合物，運用chemmapper、SwissTarget、pubchem、SEA 數據庫預測有效成分靶點；取DEGs 與藥物預測靶點的交集，整合轉錄組學與網絡藥理學構建 “藥物-成分-靶點-疾病” 網絡，預測黃芪抗阿霉素心肌細胞毒性的分子機制，并建立阿霉素心肌細胞毒性細胞模型，對可能的分子機制進行驗證，從而為黃芪的臨床應用提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 數據庫及軟件

TCMSP，PubChem，SwissTargetprediction，PharmMapper，ChemMapper，SEA，GEO 數據庫，VENNY 2.1.0，STRING，Uniprot，PDB，Graphpad prism 8.0.2，Cytoscape 3.7.2，PyMOL 1.8，R 4.1.0，AutoDockTools 1.5.6 及Vina 1.1.2。

1.2 細胞株、試驗藥物

大鼠胚胎心肌細胞H9C2 為山西中醫藥大學科研實驗中心細胞室保存；黃芪注射液（黑龍江珍寶島藥業股份有限公司，批號：A03201104 295，規格為每支裝10 mL，相當于原藥材20 g）；阿霉素（美國MCE 生物科技公司，批號：97451，規格為每瓶50 mg）。

1.3 試劑

胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM 高糖培養基購自博士德生物工程有限公司；青-鏈霉素、0.25%（體積分數）胰蛋白酶消化液（不含EDTA，不含酚紅）、0.25%（體積分數）胰蛋白酶消化液（含EDTA，不含酚紅）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；1×PBS、MTT、DMSO 購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol、擴增試劑盒、逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司；細胞凋亡試劑盒購自北京賽文創新生物科技有限公司；細胞周期試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；水為超純水；甲醇、磷酸為色譜純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司。

1.4 儀器

Waters 高效液相色譜儀；生物安全柜購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠；CO2培養箱購自英國New BRUNSWICK；離心機購自德國Eppendorf；熒光定量PCR 儀購自美國Thermo公司；Multiskan FC 酶標儀購自美國Thermo Fisher 公司。

1.5 黃芪有效成分及其潛在靶點預測

以huangqi（黃芪）為關鍵詞，在TCMSP 數據庫中檢索其活性成分，篩選條件為藥物相似性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%；利用Pubchem 數據庫獲取SMILES 號、3D 結構文件用于化合物的靶點預測和后續的分子對接。根據靶點活性成分，檢索chemmapper、SwissTarget、Pubchem、SEA 數據庫預測其靶點。

1.6 獲取阿霉素心肌細胞毒性相關靶點

以“doxorubicin cardiotoxicity”為關鍵詞，在基因表達數據庫（GEO）篩選并下載兩套符合條 件 的 基 因 芯 片 數 據（GSE79413 和GSE157282），獲取阿霉素處理組與正常對照組的基因表達譜［10］。使用R 4.1.0 中limma 包進行處理，篩選出正?？瞻捉M與阿霉素模型組之間的DEGs，篩選條件：（1）采用t檢驗，定義校正后P＜0.05；（2）|logFC| ≥1，FC表示差異倍數（Fold change），繪制火山圖。

1.7 構建 “藥物-成分-靶點-疾病” 網絡及篩選核心靶點

采用VENNY 在線程序，將化合物靶點與疾病靶點取交集獲得潛在治療靶點，繪制韋恩圖。運用Cytoscape 軟件將活性成分與潛在治療靶點進行可視化，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。將潛在治療靶點導入STRING 數據庫，獲得蛋白互作網絡圖（PPI），挖掘蛋白互作網絡中的核心基因。

1.8 GO分析和KEGG分析

通過R 4.1.0 軟件，安裝Bioconductor 中DOSE、pathview 和limma 等程序包，對核心網絡基因進行GO 富集分析與KEGG 通路分析。

1.9 主要活性成分與核心靶點的分子對接

利用PubChem 數據庫下載小分子配體3D結構，借助Chem3D 17.1 能量最小化，作為分子對接的配體分子。通過PDB 數據庫獲取對接靶點的3D 結構文件，借助PyMOL 軟件去除配體、去水、加氫等，作為受體分子。運用AutoDockTools 1.5.6 轉換結構文件格式為pdbqt，通過vina 進行分子對接。配體分子與靶點之間存在結合活性時對接分數＞4.25，結合活性較高時對接分數＞5.0，存在強烈的結合活性時對接分數＞7.0［11］。采用PyMOL 軟件對選定結果進行可視化。

1.10 黃芪注射液的HPLC分析［12］

對照品溶液的制備：制備濃度均為50 μg/mL 的槲皮素、異鼠李素及刺芒柄花素的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：將黃芪注射液30 倍濃縮，取2 mL 濃縮后黃芪注射液，用甲醇定容至10 mL，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，超聲30 min，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長為254 nm。流動相為A：甲醇，B：體積分數0.4% 磷酸水；線性洗脫條件為：0 min～5 min：10% ～15% A；5 min～10 min：15% ～20% A；10 min～15 min：20% ～25% A；15 min～20 min：25% ～35% A；20 min～30 min：35% ～37% A；30 min～35 min：37% ～40% A。

1.11 細胞實驗驗證

在DMEM 高糖培養基（含體積分數10%的胎牛血清及體積分數1%青鏈霉素溶液）中培養大鼠心肌細胞H9C2。以0.7×104個/孔接種處于對數生長期的H9C2 細胞至96 孔板，培養12 h，用梯度濃度DOX（0、0.1、0.25、0.5、1 μg/mL）處理12 h［13］。MTT 法檢測細胞活力，以半數抑制濃度（IC50）作為模型濃度。按前述方法接種細胞，給藥組用不同濃度的黃芪注射液（25、50、75、100、150、200、400 mg/mL）處理細胞［14］，培養12 h，MTT 法檢測黃芪注射液對細胞活力。研究黃芪注射液對阿霉素心肌細胞毒性的影響時實驗分組設置為正常對照組、模型組及給藥組，各設6 個復孔。接種細胞，給藥組用不同濃度的黃芪注射液（25、50、75、100、150、200 mg/mL）處理細胞，培養箱孵育12 h后，模型組和給藥組加入阿霉素，使阿霉素濃度為0.5 μg/mL，12 h 后用MTT 法測定各組細胞活力。

1.12 流式細胞術檢測H9C2細胞凋亡率

用不含EDTA 的胰蛋白酶消化液離心收集細胞，PBS 洗滌細胞兩次，再用Annexin Buffer使細胞懸浮，加入Annexin V-FITC 和PI，在避光條件下4 ℃，細胞孵育5 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.13 流式細胞術檢測H9C2周期分布

用PBS 洗滌細胞（2000 r/min，離心5 min）收集并調整細胞濃度為1×106mL-1，取1 mL 單細胞懸液，離心后去除上清，向細胞中加入500 μL預冷的體積分數70%的乙醇，于4 ℃固定12 h，使用PBS 洗滌細胞，加入提前配置好的500 μL PI/RNase A 染色工作液，室溫避光30 min～60 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.14 RT-qPCR法檢測基因相對表達差異

根據以上1.7 方法得到關鍵蛋白，通過生工生物有限公司官網上設計基因的引物序列，將引物加無酶水配成終濃度為10 μmol/L 用于后續實驗。按照1.10 方法培養細胞，然后使用總RNA 提取試劑盒提取細胞總RNA；去除基因組DNA 后進行反轉錄，將總RNA 逆轉錄成cDNA；根據擴增試劑盒說明書，以三磷酸-甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參，采用實時熒光定量PCR 方法檢測基因相對表達量，結果使用相對定量法進行分析。

1.15 數據處理

借助Graphpad 5.0 軟件進行數據處理，在方差齊性條件下采用單因素方差分析One-way ANOVA，##與空白組比較，P＜0.01；*與模型組比較，P＜0.05；**與模型組比較，P＜0.01。

2 結果

2.1 黃芪化學活性成分與靶點預測

通過檢索TCMSP 數據庫及查閱文獻，獲得黃芪有效成分21 個，如表1 所示；收集SwissTarget、chemmapper、SEA 數據庫中藥物靶標，篩選后得到活性成分靶點996 個。

2.2 差異基因的篩選

依據差異基因篩選條件，將阿霉素處理組與正常對照組比較，基因芯片GSE79413 共有185 個基因發生顯著變化，其中上調基因34 個，下調基因151 個；基因芯片GSE157282 共獲得2566 個差異表達基因，其中上調基因1537 個，下調基因1029 個。合并兩個芯片差異基因，去重包括2705 個差異基因，結果如圖1 所示。

圖1 差異表達基因火山圖（a）基因芯片GSE79413； （b）基因芯片GSE157282，紅色代表上調基因，藍色代表下調基因，篩選標準為|logFC|≥1Fig.1 Volcanic map of differential genes(a) Gene chip GSE79413; (b) Gene chip GSE157282, red represents up-regulated genes, blue represents down-regulated genes,and the screening criteria is |logFC| ≥1

2.3 黃芪化合物靶點和疾病靶點交集結果

將黃芪有效成分預測靶點、差異基因兩者的潛在靶點經過韋恩分析后，共有792 個交集靶點。

2.4 黃芪抗阿霉素心肌細胞毒性網絡模型的構建及分析

運用Cytoscape 軟件構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖，如圖2 所示。根據網絡拓撲學性質，選取degree 值較高藥物活性成分排名靠前的前五個化合物，分別是7-O-甲基異丁香酚、山柰酚、槲皮素、刺芒柄花素、異鼠李素，這五個成分很可能是黃芪抗阿霉素心肌細胞毒性的主要物質基礎。

圖2 黃芪抗阿霉素心肌細胞毒性網絡圖Fig.2 Myocardial cytotoxicity network diagram of Astragalus injection gainst adriamycin

2.5 潛在靶點PPI網絡的構建

通過STRING 數據庫，將潛在靶點按照默認參數生成PPI 網絡；導入Cytoscape 軟件獲得一個包含110 個節點的初級PPI 網絡；經拓撲分析及MCC 插件計算，依次得到含51 個節點的次級PPI 網絡與包括STAT3、AKT1、MAPK1、TP53等12 個基因的核心PPI 網絡，結果如圖3所示。

圖3 黃芪抗阿霉素心肌細胞毒性靶點PPI網絡構建及核心網絡篩選（a）黃色為初步篩選的基因；（b）橘色為拓撲分析后篩選的基因；（c）為篩選出的12個核心基因Fig.3 PPI network construction and core network screening of Astragalus anti-adriamycin cardiomyocyte toxicity target(a) Yellow indicates the preliminary gene being screened; (b) Orange indicates the screened gene after topological analysis; (c) 12 Screened core genes

2.6 GO富集分析

采用R 軟件及Bioconductor 程序包對上述藥物-疾病共同靶點進行生物過程生物過程（biological processes，BP）、細胞組分（cellular components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）3 部分篩選，每一分類校正count 值最大的前7 條目，結果如圖4 所示。BP 分類包括細胞對藥物反應、對化學應急反應、調節膜電位、調節類固醇代謝、調節脂質代謝過程等3060 個條目；CC 分類包括突觸膜、跨膜轉運復合物、膜筏、膜質微區、膜區等197 個條目；MF 分類主要包括蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、通道活動、被動跨膜轉運蛋白活性、離子通道活動、內肽酶活性參與凋亡過程等375 個條目。

圖4 GO富集分析結果Fig.4 GO enrichment analysis results

2.7 KEGG通路分析

結果表明有114 條信號通路被顯著富集，依據P＜0.05 排序得到前20 條通路，包括PI3K-AKT 信號通路、MAPK 信號通路等，如圖5 所示。其中PI3K-AKT 信號通路排名靠前，且MAPK1、AKT1等基因均在該通路發揮重要作用。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.8 黃芪主要活性成分與核心靶點的分子對接

7-O-甲基異丁香酚、山柰酚、槲皮素、刺芒柄花素、異鼠李素經Chem3D 17.1 軟件能量最小化參數分別為20.064 9、14.623 0、15.048 6、34.041 4、20.414 9 kcal/mol，TP53、STAT3、AKT1、MAPK1degree 值較高且經查閱文獻與心肌細胞毒性疾病相關。將2.4 黃芪抗阿霉素心肌細胞毒性網絡中具有最高連接度的前5 個化學成分分別與其分子對接，活性成分與關鍵靶點結合能均小于-5.0 kcal/mol，有較好的結合能力，如表2 所示。槲皮素與AKT1、TP53、MAPK1、STAT3具有最強結合能力，槲皮素與AKT1在VAL-123、LYS-72 處形成氫鍵；與TP53在GLN-72 處形成氫鍵；與MAPK1在ARG- 處形成氫鍵；與STAT3在GLU-638、GLY-656 處形成氫鍵，如圖6 所示。綜合上述結果，黃芪中活性成分可能通過調控PI3K-Akt通路中MAPK1、AKT1、TP53、STAT3核心基因發揮對阿霉素心肌細胞毒性的保護作用。

圖6 槲皮素與關鍵靶點分子對接圖（a）AKT1與槲皮素分子對接復合物的三維結構；（b）AKT1蛋白與槲皮素的詳細結合位點呈現；（c）TP53與槲皮素分子對接復合物的三維結構；（d）TP53蛋白與槲皮素的詳細結合位點呈現；（e）MAPK1與槲皮素分子對接復合物的三維結構；（f）MAPK1蛋白與槲皮素的詳細結合位點呈現；（g）STAT3與槲皮素分子對接復合物的三維結構；（h）STAT3蛋白與槲皮素的詳細結合位點呈現Fig.6 Docking diagram of quercetin with key target molecules(a) Three-dimensional structure of AKT1-quercetin complex; (b) Detailed binding sites of quercetin in AKT1 protein;(c) Three-dimensional structure of TP53-quercetin complex; (d) Detailed binding site of quercetin in TP53 protein;(e) Three-dimensional structure of MAPK1-quercetin complex; (f) Detailed binding sites of quercetin in MAPK1 protein;(g) Three-dimensional structure of STAT3-quercetin complex; (d) Detailed binding site of quercetin in STAT3 protein

表2 黃芪有效成分與核心基因的分子對接Table2 Molecular docking between the effective components of Astragalus and core genes

2.9 黃芪注射液的HPLC分析

本研究采用HPLC 檢測黃芪注射液中槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素的含量。依照方法學考察要求，分別進行精密度、穩定性、重復性及加樣回收率考察，結果分別為精密度：槲皮素峰面積RSD 為1.1%，異鼠李素峰面積RSD為1.6%，刺芒柄花素峰面積RSD 為1.5%；穩定性實驗分別于0、2、4、6、8、12 h 測定黃芪注射液供試品溶液中槲皮素峰面積RSD 為1.1%，異鼠李素峰面積RSD 為1.2%，刺芒柄花素峰面積RSD 為1.2%；考察重復性時取黃芪注射供試品溶液，依法平行測定5 份，槲皮素峰面積RSD 為1.1%，異鼠李素峰面積RSD 為1.5%，刺芒柄花素峰面積RSD 為1.1%；對槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素做加樣回收率的考察，得槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素平均回收率分別為97.04%、98.75%、99.59%，RSD 分別為0.3%、0.5%、1.2%。

標準化合物的校準曲線方程槲皮素：Y=3E+06X+120 975，R2=0.999 8；異鼠李素：Y=4E+06X+142 692，R2=0.996 9；芒柄花素：Y=7E+06X-19 336，R2=0.999 2。記錄峰面積并按外標法計算樣品含量，每樣品平行測定3 次，取平均值，計算得黃芪注射液中槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素含量分別為0.447 7、0.240 7、0.281 2 μg/mL，見圖7。

圖7 對照品及黃芪注射液在254 nm處的HPLC色譜圖（a）對照品；（b）黃芪注射液；1-刺芒柄花素；2-槲皮素；3-異鼠李素Fig.7 HPLC chromatograms of reference substance and Astragalus injection at 254 nm(a) mixed reference substance; (b) Astragalus injection; 1-formononetin; 2-quercetin; 3-isorhamnetin

2.10 不同濃度阿霉素對心肌細胞的毒性

隨著阿霉素濃度（0、0.1、0.25、0.5、1.0 μ g/mL）的增加，細胞存活率顯著下降，除0.1 μ g/mL 組外，與正常對照組相比，其余各劑量組細胞存活率均具有極顯著性差異（P＜0.01），如圖8 所示。計算阿霉素的IC50 值為0.519 0 μg/mL，選取阿霉素0.5 μg/mL 作為模型濃度。

圖8 阿霉素濃度對細胞存活的影響Fig.8 Effect of adriamycin concentration on cell survival

2.11 不同濃度黃芪注射液對心肌細胞的保護

隨著黃芪注射液濃度（0、25、50、75、100、150、200、400 mg/mL）的增加，細胞存活率逐漸升高，當濃度達到400 mg/mL 組時，與正常對照組相比細胞存活率顯著降低（P＜0.01），如圖9 所示。

圖9 黃芪注射液對細胞存活的影響Fig.9 Effect of Astragalus injection on cell survival

2.12 黃芪注射液抗阿霉素心肌細胞毒性

黃芪注射液可以促進阿霉素毒性心肌細胞的增殖，且呈劑量依賴性，在200 mg/mL 處發揮最佳的保護效果（P＜0.01），如圖10 所示。

圖10 黃芪注射液對阿霉素毒性細胞存活的影響Fig.10 Effect of Astragalus injection on the survival of adriamycin toxic cells

2.13 黃芪注射液減少阿霉素誘導的心肌細胞凋亡

如圖11 所示，圖11（a）中左上象限Q1 代表壞死細胞，右上象限Q2 代表晚期凋亡細胞，右下象限Q3 代表早期凋亡細胞，左下象限Q4 代表活細胞，細胞凋亡率為Q2 與Q3 象限百分率之和。與對照組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，黃芪注射液在75、100 mg/mL 可以顯著減少 H9C2 細胞凋亡（P＜0.01）。

圖11 黃芪注射液對阿霉素毒性的 H9C2 細胞凋亡的影響Fig.11 Effect of Astragalus injection on apoptosis of adriamycin toxic H9C2 cells

2.14 黃芪注射液調節細胞周期減輕阿霉素心肌細胞毒性

結果顯示，與對照組相比，模型組細胞G1 期顯著減少，G2 期顯著升高（P＜0.01），表明細胞在G1 期被促進，G2 期被阻滯；與模型組比較，給藥組黃芪注射液在 75、100 mg/mL 時G1 期細胞顯著升高，G2 期細胞顯著減少（P＜0.01），如圖12 所示。

圖12 黃芪注射液對阿霉素毒性的 H9C2 細胞周期的影響（a）對照組；（b）DOX 組；（c）黃芪注射液 75 mg/mL；（d）黃芪注射液 100 mg/mL；（e）各組H9C2細胞中G1、G2細胞周期的變化。（a）、（b）、（c）、（d）圖中草綠色為G1期，亮藍色代表G2期Fig.12 Effect of Astragalus injection on H9C2 cell cycle induced by adriamycin toxicity(a) Control group; (b) DOX group; (c) Astragalus injection 75 mg/mL ; (d) Astragalus injection 100 mg/mL ; (e) Changes in the G1 and G2 cell cycles of each group of H9C2 cells.Grass green represents G1 phase , and light biue represents G2 phase in(a), (b), (c), and (d)

2.15 黃芪注射液抗阿霉素對核心基因mRNA 表達的調節

通過熒光定量PCR 檢測核心基因mRNA 相對表達量發現：阿霉素造模后，MAPK1、TP53、STAT3基因mRNA 相對表達量均出現上調趨勢，AKT1基因mRNA 相對表達量出現下調趨勢，隨著黃芪注射液給藥濃度的增加，MAPK1、TP53、STAT3基因mRNA 相對表達量減少，AKT1基因mRNA 相對表達量上升，如圖13 所示。

圖13 黃芪注射液對AKT1、TP53、MAPK1、STAT3 mRNA相對表達量的影響Fig.13 Effects of Astragalus injection on mRNA expression levels of AKT1, TP53, MAPK1 and STAT3

3 討論

化療藥物阿霉素臨床應用呈現出廣泛嚴重的心臟毒性，發現時通常已心力衰竭［15］。臨床觀察發現黃芪注射液可以改善患者心臟功能，治療慢性頑固性心衰［16］。黃芪注射液聯合右丙亞胺可以改善心功能，減少心電圖發生異常的情況，使心臟各項生化指標趨于正常，從而達到防治阿霉素所致化療后心臟毒性的功效［17］。但是其發揮作用的有效成分和分子機制尚不清晰，故本研究采用DOX 誘導H9C2 建立心肌細胞毒性模型，結合網絡藥理學和實驗驗證初步探析黃芪抗阿霉素心肌細胞毒性的有效成分和作用機制，為黃芪注射液臨床應用提供理論基礎。

多項研究表明黃芪參與調控多種生物過程，包括細胞程序性死亡、抗氧化等，其成分發揮補氣、強心、等功效主要是通過皂苷類、槲皮素、毛蕊異黃酮等關鍵成分發揮作用［18-20］。研究發現PI3K/Akt 通路與心血管疾病預防和治療密切相關，該通路通過調控細胞周期、細胞凋亡不同階段的相關凋亡因子、心肌細胞的增值、自噬與壞死等過程控制心肌細胞存活和功能［21］。研究還發現絞股藍中槲皮素能夠通過調節P53、AKT、MAPK 等信號分子，調節氧化應激、線粒體穩態達到防治阿霉素心肌病的目的［22］。本研究網絡分析結果表明黃芪可能通過調控PI3K-Akt、P53、MAPK 等信號通路中核心基因MAPK1、AKT1、TP53、STAT3對阿霉素所致心肌細胞毒性發揮保護作用。分子對接結果提示，活性成分槲皮素與AKT1、TP53、MAPK1、STAT3關鍵靶點結合打分均較高，為中藥單體對阿霉素減毒作用研究提供參考［23］。

研究發現黃芪注射液對心肌細胞保護作用主要通過減輕小鼠心臟肥大，提高心肌內GSH含量，穩定線粒體膜電位，抑制心肌細胞發生異常凋亡來實現［24］。研究發現黃芪注射液能顯著減輕阿霉素所致小鼠心肌組織病理及超微結構損傷，并有效維護其心肌纖維及膜系統的穩定性［25］。研究表明STAT3參與細胞內基因轉錄，調控細胞增殖、凋亡等反應［26］。研究還發現硫化氫可能通過下調STAT3改善MMPs/TIMPs 失調，從而改善高甲狀腺素誘導的心肌纖維化［27］。腫瘤蛋白P53（TP53）為PI3K/PTEN/AKT 信號通路關聯基因之一，為常見促癌基因，且參與眾多腫瘤發?。?8］。TP53通過調節下游靶基因的轉錄，合成細胞周期相關蛋白，調控細胞增殖和凋亡，并且在多種腫瘤的發生發展以及治療和預后方面扮演重要角色［29］。AKT 參與癌癥、心血管等疾病的發生發展，通過調控細胞周期、細胞存活等多種生物過程發揮作用。苗艷菊等從正反兩方面研究證實AKT1可以促進心肌纖維化，主要是通過促進炎性反應，導致成纖維細胞轉分化實現的［30］。研究表明MAPK 在心肌纖維化的信號調控中發揮著重要的作用［31］。本研究網絡分析中，7-O-甲基異丁香酚、山柰酚、槲皮素、刺芒柄花素、異鼠李素顯示了較高的度值，分子對接打分提示槲皮素與AKT1、TP53、MAPK1、STAT3具有最強結合能力；體外細胞實驗證實，黃芪注射液可以調節細胞周期，減少阿霉素導致的心肌細胞凋亡，其機制為調控核心基因STAT3、TP53、AKT1、MAPK1的表達來發揮作用。該研究結果為黃芪抗阿霉素心肌細胞毒性的有效成分和作用機制提供理論基礎。

綜上所述，本研究闡述了黃芪抗阿霉素心肌細胞毒性的有效活性成分、關鍵靶點及重要通路，并在理論上預測中藥單體槲皮素有保護阿霉素心肌細胞毒性的潛力，下一步應更深入研究中藥單體槲皮素抑制阿霉素心肌細胞毒性的具體機制，并進一步通過體內實驗驗證黃芪注射液抗阿霉素心肌細胞毒性的作用機制，為臨床減輕阿霉素引起的心臟毒性提供參考。