防控甜瓜枯萎病病菌的生防菌篩選及其根際定殖

李青　謝昶琰　張苗　孫春梅　陳川　章安康

摘要： 為了開發在農業實踐中能夠穩定發揮功能的生防菌資源，本研究從甜瓜根際挖掘具有良好根際定殖能力的抗甜瓜枯萎病病菌生防菌株。通過繼代培養法、平板對峙法、發芽率測試和盆栽試驗篩選出對甜瓜枯萎病有較強防控作用的生防菌株R1-3，經該菌發酵液處理的甜瓜植株對甜瓜枯萎病病菌的防效達50.04%，且菌株發酵液處理能夠促進甜瓜植株的生長。根際定殖相關因素的測試結果表明，菌株R1-3能形成強健的生物膜結構且對不同質量濃度的甜瓜根系分泌物均具有顯著趨化性，具備良好的根際定殖能力。該菌株對不同植物?；图怄哏牭毒吐莶〔【灿幸欢ǖ囊种谱饔?，且具有分泌吲哚乙酸（IAA）、溶解無機磷及耐鹽能力。通過菌株16S rDNA序列分析，將R1-3初步確定為芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.）。

關鍵詞： 甜瓜枯萎??；生防菌；防病和促生作用；根際定殖；趨化性

中圖分類號： S652 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）02-0336-08

Screening of antagonistic bacteria against muskmelon Fusarium oxysporum and their colonization on rhizosphere

LI Qing， XIE Chang-yan， ZHANG Miao， SUN Chun-mei， CHEN Chuan， ZHANG An-kang

（Huaiyin Institute of Agricultural Sciences of Xuhuai Region in Jiangsu Province， Huaian 223001， China）

Abstract： To explore antagonistic bacterium materials that can play a stable role in agricultural practice， this research aimed to screen antagonistic bacteria against muskmelon Fusarium oxysporum which were easy to colonize in the rhizosphere. Strain R1-3 with strong antagonistic effect against muskmelon F. oxysporum was screened by using successive transfer culture method， plate confrontation method， germination rate test and pot experiment. Muskmelon treated by fermentation solution of R1-3 showed 50.04% control efficiency to muskmelon Fusarium wilt and the treatment could promote the growth of muskmelon. Test results of rhizosphere colonization-related factors showed that， strain R1-3 had fine rhizosphere colonization ability because it could form strong biofilm structure and had significant chemotaxis to musk melon root exudates with different mass concentrations. This strain had inhibitory effects on different plant specialized F.oxysporum and Stagonosporopsis spp.， it also had the abilities of secreting indole-3-acetic acid （IAA）， dissolving inorganic phosphorus and salt tolerance. Based on the phylogenetic analysis of 16S rDNA， strain R1-3 was preliminary identified as Bacillus sp..

Key words： muskmelon Fusarium wilt;antagonistic bacteria;disease prevention and growth promotion effect;rhizosphere colonization;chemotaxis

甜瓜屬于中國廣泛栽種的經濟作物，近年來其產業經濟效益較高，在種植業中的地位不斷提升^[1-2]。但是長年連續種植甜瓜會導致農田土壤病原微生物積累，造成土傳病害頻發，連作障礙已成為甜瓜可持續生產的重要限制因素之一^[3]。特別是尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）導致的甜瓜枯萎病、蔓枯病病菌（Stagonosporopsis spp.）引起的甜瓜蔓枯病等，在連作地發生的概率很高，嚴重影響甜瓜的產量和品質^[4]。目前這些土傳病害的防治主要依賴化學藥劑，但化學藥劑的長期使用易使病原菌產生抗藥性，且易造成安全隱患^[5]。相比之下，生物防治因其環境友好和經濟投入較少等優點而受到廣泛的關注和認可^[6]。許多芽孢桿菌屬細菌不僅能夠產生抗菌活性物質拮抗病原菌，還具有植物促生特性，在生物防治中發揮著重要作用^[7]。然而，盡管多數生防菌在室內條件下具有良好的防病效果，但它們在農業生產應用中對病害的實際防效依然有限，效果往往不穩定^[8-9]。首先，許多生防菌是在富營養的培養基中被分離篩選出來的^[10-12]，未必能適應土壤中較貧瘠的營養條件。其次，很多研究在篩選過程中多以平板對峙試驗中生防菌對病原菌的抑制率作為主要篩選指標^[12-14]，而平板抑制率僅能表征菌株產生拮抗物質的活性與能力。菌株充分發揮生防功能的重要前提是其在植物根際能夠有效定殖^[15]。影響細菌根際定殖的關鍵因素包括菌株對植物根系分泌物的趨化性和自身生物膜的形成能力^[16]。根系分泌物中包含的信號物質能夠調控細菌向根表趨化運動^[17]，停留在根表的細菌群體分泌胞外基質（主要成分為蛋白質、多糖和胞外DNA等），將自身包裹而形成膜樣的細菌群體聚合物，細菌群體聚合物被稱為生物膜，可為其提供一種受保護的、競爭力更強的生存模式^[18-19]，因而有益細菌向根表趨化并聚集成膜是其發揮抑病促生功能的關鍵。為獲得在植物根際能夠穩定發揮功能的微生物，本研究在貧營養條件下采用傳統的生防菌篩選方法，同時結合菌株生物膜形成能力和對根系分泌物趨化性的評估，分離篩選獲得1株具有防病促生效果和良好根際定殖能力的芽孢桿菌屬細菌R1-3，并探索了其潛在的促生因子、耐鹽能力以及拮抗多種病原菌的特性。研究結果能夠為生防菌株的篩選應用提供新的思路及資源，有助于減少對農用化學品的依賴以及促進甜瓜產業健康和可持續發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣品采集：甜瓜植株及其根際土壤樣品采自江蘇省淮安市甜瓜枯萎病發生地塊，于甜瓜收獲期隨機選取靠近枯萎病發病株附近的健康植株，連根帶土采集其根系用于菌株分離。

供試病原菌：甜瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. melonis），菌種編號為ACCC36102，購自中國農業微生物菌種保藏管理中心。尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. niveum）、蔓枯病病菌（Stagonosporopsis spp.）由淮安市農業科學院蔬菜中心提供。尖孢鐮刀菌黃瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. cucumerinum）由南京農業大學資源與環境科學學院提供。

供試培養基：細菌的分離篩選參照Sun等^[20]的方法，采用貧營養的1/10胰酪大豆胨（TSA）培養基（胰蛋白胨1.5 g，大豆蛋白胨0.5 g，氯化鈉0.5 g，瓊脂20.0 g，用蒸餾水定容至1.0 L）。拮抗效果鑒定使用平板對峙培養法，采用PDA培養基^[11]。生物膜測試參照張楠^[21]的方法，采用MSgg培養基。IAA產量測定的樣品制備參照陳小娟^[22]的方法，采用添加L-色氨酸的Landy培養基。溶磷能力的測定參照劉娜^[23]的方法，使用蒙金娜無機磷培養基。菌株耐鹽能力檢測參照李晉等^[24]的方法，使用添加不同質量濃度氯化鈉的牛肉膏蛋白胨培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 根際及內生細菌的分離純化 抖落植物根部松散的附著土，剪成長約3 cm的小段，稱量植物根及其根際土10 g倒入盛有90 ml無菌水和滅菌玻璃珠的三角瓶內振蕩30 min，取1 ml土壤懸液經系列梯度稀釋后涂布于1/10 TSA平板上。30 ℃倒置培養1～2 d后，挑取形態不同的菌落，經劃線純化后制備甘油管，保存至-80 ℃冰箱。內生菌分離時需對根進行表面消毒（用2%次氯酸鈉浸泡15 min，用70%乙醇浸泡5 min，用無菌水沖洗干凈），然后剪成1 cm左右的碎塊，立即轉移至無菌研缽中研磨，最后轉移至上述三角瓶內，其余操作和根際細菌分離純化步驟相同。

1.2.2 生防菌的初步篩選 以甜瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌作為指示菌，采用對峙培養法^[14]，測試保存菌株的拮抗效果。先活化病原菌，再沿菌落邊緣打孔獲取直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA平板中央。28 ℃培養2 d后，將分離得到的細菌按1%的接種量在1/10 TSA液體培養基中過夜活化并點接2 μl至病原菌菌片兩邊，點接處距離病原菌中心2.5 cm，對照為單獨接種尖孢鐮刀菌菌餅的平板，28 ℃培養7～8 d，觀察是否有抑制效果，參照文獻[14]計算其抑制率，選擇抑制效果明顯的菌株用于后續研究。菌株對不同病原菌的平板拮抗效果試驗與此步驟相同。

將上述獲得的菌株在1/10 TSA液體培養基中進行20次傳代培養，選取第1、第5、第10、第15和第20代的菌液進行平板對峙試驗，測量病原菌被抑制的菌落半徑（r），篩選出在傳代過程中對甜瓜尖孢鐮刀菌的拮抗效果較穩定的菌株^[25]。

將拮抗效果穩定的菌株分別接種至TSA液體培養基中，振蕩（30 ℃，170 r/min）培養24 h制成含量約為1×10⁸CFU/ml的菌懸液用于種子發芽率測試，對照為空白TSA培養基。挑取外觀一致的甜瓜種子，用體積分數70%的乙醇溶液對種子進行表面消毒后使用無菌水沖洗干凈。分別將種子放入上述生防菌菌懸液和空白TSA培養基中浸泡2 h，取出種子后置于滅菌培養皿內的濕潤無菌濾紙上，每個處理50粒種子，3次重復。30 ℃條件下催芽36 h，統計并計算種子的發芽率^[25]。

1.2.3 盆栽防效及促生試驗 甜瓜種子催芽后在滅菌基質中播種育苗14 d，生防菌菌懸液制備參照方法1.2.2，在每株甜瓜根圍分別接種3 ml含量為1×10⁸CFU/ml的生防菌菌懸液，每個處理21株甜瓜，重復3次，空白對照設置為添加等量無菌TSA培養基。參照張美君等^[12]的方法制備甜瓜枯萎病病原菌孢子懸液，生防菌菌懸液接種5 d后，在每株甜瓜根圍接種2 ml甜瓜枯萎病病原菌孢子懸液（含量為1 ml 1×10⁶個），于病原菌接種20 d后統計植株發病情況，參照郝芳敏等^[11]的方法計算病情指數和防病效果。

甜瓜種子催芽后在滅菌基質中播種育苗14 d，挑選長勢一致的幼苗，參照上述方法進行生防菌菌懸液接種，接種18 d后統計不同處理甜瓜苗的株高和鮮質量。

1.2.4 菌株生物膜形成試驗 將過夜活化的生防菌菌株振蕩培養，待其OD₆₀₀達到1.0時，離心（5 000 r/min，5 min）收集菌體并用等體積的無菌水重懸。生物膜形成試驗采用48孔細胞培養板，每孔接種1 ml MSgg培養基^[21]和10 μl菌懸液，每處理設8個重復，以無菌水為對照，30 ℃條件下靜置培養，在培養24 h和48 h時觀察不同處理的生物膜形成情況。選取培養48 h形成的生物膜用于定量測定，將培養孔中的浮游生物膜及液體培養基在無菌條件下轉移至細胞濾器（濾膜孔徑為100 μm）中過濾，留在細胞濾網上的生物膜連同細胞濾器一起放置于超凈工作臺內吹干并稱質量。

1.2.5 甜瓜根系分泌物的收集 甜瓜播種育苗30 d后輕輕拔起幼苗，將根部雜質沖洗干凈，放入裝有100 ml無菌去離子水的三角瓶中，每瓶2棵幼苗，培養24 h后收集三角瓶中的液體，置于冷凍干燥機中抽干，用去離子水將凍干物溶解，使其質量濃度為1 mg/ml，用濾膜（孔徑為0.22 μm）過濾，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.6 菌株對甜瓜根系分泌物的趨化試驗 趨化定量試驗參照文獻[26]，采用1 ml注射器作為毛細管，分別吸取100 μl不同質量濃度梯度（0.03 mg/ml、0.10 mg/ml、0.30 mg/ml、1.00 mg/ml）的甜瓜根系分泌物溶液，以無菌水為對照。待測菌株菌懸液制備參照方法1.2.4。使用無菌移液槍頭（規格為200 μl）吸取菌懸液100 μl，將注射器的針頭輕輕裝入200 μl移液槍頭內，放置于超凈臺內30 min，梯度稀釋注射器中的溶液并進行平板涂布計數，獲得注射器溶液中的菌落數，每個處理3次重復。趨化性指數（RCI）=處理菌落數的平均值/相應對照菌落數的平均值，一般當RCI≥2時^[26]，則認為與對照相比，處理的趨化性具有顯著差異。

1.2.7 菌株的根際定殖試驗 分別將菌株R1-3和R1-6接種至TSA液體培養基中，振蕩培養（35 ℃，180 r/min）30 h左右，使菌株發酵液含量為1×10⁹CFU/ml。將各菌株發酵液按照5%（體積比）的比例接種至滅菌基質中，混合均勻。甜瓜種子催芽后播種于基質中育苗16 d，輕輕拔起幼苗并將根上的基質抖落，稱取1 g根放置于含9 ml無菌水的離心管中，使用渦旋儀劇烈振蕩，吸取懸液進行梯度稀釋和平板涂布計數，菌株數量以每克根質量計，用CFU/g表示。

1.2.8 菌株促生、耐鹽特性研究 按照細菌IAA檢測試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司產品）說明書測定菌株IAA的產量。菌株溶磷能力的測定參照文獻[23]。使用NaCl將牛肉膏蛋白胨培養基平板分別調至不同的鹽含量（3%、5%、8%、11%和13%，質量體積比），將菌株劃線接種至這些平板上并觀察其生長狀況，測試菌株的耐鹽能力。

1.2.9 菌株的分子鑒定及系統發育樹的構建 參照陳小娟^[22]的方法，提取菌株R1-3的總基因組DNA，使用通用引物27F和1492R^[22]進行16S rDNA序列擴增，對PCR擴增產物進行清潔回收并委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果在美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫中進行BLAST同源性比對，選取同源性較高且具有代表性的序列下載。使用MEGA 11.0內置ClustalW命令進行多序列比對，去除間隔后，通過自動分析找到最佳核酸替換模型為Kimura 2+Gamma分布，基于該模型構建Bootstrap為500的最大似然進化樹，進化樹采用FigTree 1.4.4制作。

1.3 數據分析

數據處理采用Microsoft Excel 2016軟件，統計分析采用SPSS 19軟件。

2 結果與分析

2.1 生防菌株的分離與初篩

本試驗從供試樣品中分離獲得根際菌株（用S表示）及內生菌株（用R表示）共122株，通過PDA平板對峙試驗，發現其中12株菌株對甜瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌有拮抗能力。在繼代培養試驗中，當在1/10 TSA液體培養基中連續培養至20代時，只有8株菌株仍對病原菌有一定的拮抗能力（表1）。因此推斷這些菌株抑制甜瓜枯萎病病原菌的能力具有較好的穩定性，在農業實踐中具有持續發揮作用的潛力。甜瓜種子發芽率測試結果（圖1）表明，除了菌株R1-11外，其余7株菌株處理后的甜瓜種子發芽率為86.0%～95.3%，與對照的種子發芽率（90.7%）相比差異不顯著（P>0.05），表明這7株菌株不影響甜瓜種子的發芽情況，可用于進一步試驗。

2.2 生防菌對甜瓜的防病和促生效果

在平板對峙培養試驗中，5株菌株的抑制率大于50%，其中菌株R1-6對甜瓜尖孢鐮刀菌的平板抑制效果最強，抑制率達到59.2%（圖2、表2）。在溫室盆栽防效試驗中，當病原菌接種20 d后，病害防控效果突出的菌株為R1-3和R1-1，病情指數分別下降50.2%和48.3%，防病效果分別達50.04%和48.41%（表2）。在促生試驗中，生防菌接種18 d后，發現R1-3菌懸液處理可以顯著提高盆栽甜瓜植株的株高和鮮質量，與對照相比，甜瓜苗株高增加了12.4%，鮮質量增加了25.0%（表2），表明菌株R1-3對甜瓜幼苗具有一定的促生作用。綜上所述，經菌株R1-3處理的甜瓜苗發病最輕且具有促生效果，綜合表現最佳。試驗還發現，生防菌的實際防治效果和平板上的抑制率并不具有相對應的關系。

2.3 生防菌株的生物膜形成能力、對根系分泌物的趨化性及其根際定殖研究

由上述分析可知，平板抑制率最高的菌株R1-6，其實際防效卻并不理想，而菌株R1-1和R1-3盡管平板抑制率不是最佳，卻有更好的實際防效。為了進一步探索其中的原因，以菌株R1-1、R1-3和R1-6為研究對象，分別測試不同菌株的生物膜形成能力及其對甜瓜根系分泌物的趨化能力。在靜態培養條件下3株菌株的生物膜逐漸成熟，培養時間達到48 h時，生物膜呈現出褶皺復雜且致密的狀態（圖3）。定量試驗結果表明，3株菌株的生物膜質量（24孔細胞培養板中1個孔的生物膜質量）分別為20.55 mg、21.32 mg和22.31 mg，三者之間差異不顯著（P>0.05），說明3株菌株都能夠形成強健的生物膜結構。趨化定量試驗結果（圖3）表明，在0.01～1.00 mg/ml甜瓜根系分泌物質量濃度范圍內，隨著根系分泌物質量濃度的升高，3株菌株的趨化性指數都呈現先升高再降低的趨勢。菌株R1-1表現出對低質量濃度根系分泌物（0.01～0.03 mg/ml）的趨化性不顯著（RCI<2），對較高質量濃度的根系分泌物（0.10～1.00mg/ml）趨化性顯著（RCI≥2）。而菌株R1-3在測定范圍內對任意質量濃度的根系分泌物都具有顯著趨化性，表明該菌對甜瓜根系分泌物的趨化性較強，可推測其在土壤環境中更容易向甜瓜根際趨化從而實現在根表的定殖成膜。在根系分泌物質量濃度為0.10 mg/ml和0.30 mg/ml時，3株菌株的趨化性都具有顯著性差異，但菌株R1-6的趨化性指數（RCI）最低，且R1-6對其他質量濃度的根系分泌物趨化性都不顯著，表明菌株R1-6對甜瓜根系分泌物的趨化現象較弱，這很可能造成其根際定殖能力較差并導致其實際防效不佳。為了驗證推測，選取菌株R1-3和R1-6為研究對象，測試其根際定殖數量。結果表明，育苗16 d后，菌株R1-3在甜瓜根際的定殖數量達1.84×10⁷CFU/g，而菌株R1-6的定殖數量顯著低于R1-3，僅有2.2×10⁶CFU/g，說明其根際定殖能力較差。

2.4 菌株R1-3的其他生物學特性

菌株R1-3與不同植物（西瓜、黃瓜）?；图怄哏牭毒奥莶〔【钠桨鍖χ旁囼灲Y果（圖4）表明，該菌也能夠抑制這3種供試病原菌的生長。促生因子的定量測定結果表明，菌株R1-3具有一定的產吲哚乙酸（IAA）、溶解無機磷的能力，其分泌IAA的量為1.27 mg/L，溶磷量為39.65 mg/L，這可能是該菌促進植物生長的原因。耐鹽能力檢測結果表明，菌株R1-3最高可耐受11%（質量分數）的NaCl，達到中度的耐鹽水平^[24]，推測其在連作條件導致的鹽漬化土壤中具有一定的生存能力。綜上，可將菌株R1-3作為防控植物病害和促進植物生長的功能菌進行開發和利用。

2.5 菌株系統鑒定

將菌株R1-3的16S rDNA序列提交到NCBI中進行比對，利用FigTree 1.4.4軟件構建系統發育樹，如圖5所示，R1-3與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）FZB42在同一分支，相似性最高，初步鑒定R1-3為芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.）。

3 討論

芽孢桿菌具有生長速度快、環境友好以及抗逆性強等特點，在防控植物病害和促進作物生長等方面都具有良好的表現，應用前景廣闊^[27-29]。本研究首先在貧營養條件下分離細菌，然后初篩出能夠穩定拮抗甜瓜枯萎病病菌且不影響種子發芽率的生防菌株，進一步利用溫室盆栽試驗復篩出對甜瓜幼苗枯萎病防控效果較好且具有促生作用的菌株R1-3。該菌被鑒定為芽孢桿菌屬細菌，與貝萊斯芽孢桿菌的同源性較近，在以后的工作中需要進一步確定其具體到種的分類地位。

生防芽孢桿菌可通過多種機制幫助植物抵御病原菌侵染，例如產生抗生素抑制病原菌生長、與病原菌競爭養分和生態位及誘導植物系統產生抗性等^{[16，30-34]}，也可通過產植物激素IAA、溶磷增加養分獲取等促進植物生長的方式間接發揮其生防功能^[35]。菌株R1-3能夠抑制不同植物?；图怄哏牭毒吐莶〔【纳L，可通過產IAA、溶磷等方式提高甜瓜幼苗株高及鮮質量，兼具抵御病害和促生功能，然而其具體防病機制還有待更深入的研究。

研究中發現不能簡單地將生防菌的平板抑菌能力直接等同于該菌的病害防控能力。楊迪等^[36]在篩選鑒定香蕉枯萎病拮抗菌過程中發現拮抗菌盆栽防效強弱與其平板測試的抑菌活性高低并不一致。說明在篩選過程中，如果僅以實驗室條件下的平板抑制率對菌株進行取舍，很可能會遺漏一些實際防效好的菌株。王亞嬌等^[37]的研究也充分證實這一點，所以，提倡將平板對峙試驗和溫室生物學指標測定（包括菌株對植物生長的影響及防病效果測定）結合起來，才能夠更準確地評估拮抗菌的生防能力。本研究中的菌株篩選思路與此一致，然而此方法在篩選對象數目較多時，大量候選菌株的溫室生物學指標測定會產生較大的工作量。相關研究結果表明，微生物功能的穩定發揮還要依賴于其在植物根際能夠有效定殖^[15]，菌株在植物根際的定殖能力又與其對根系分泌物的趨化性和生物膜形成能力緊密相關^[16]。因此，本研究進一步探索了試驗中獲得的代表性菌株的生物膜形成能力、趨化性及根際定殖能力，試驗結果與上述觀點一致。實際病害防控能力最好的菌株R1-3對不同質量濃度的甜瓜根系分泌物都具有顯著趨化性，還能形成強健的生物膜，并且具有較強的根際定殖能力。而在平板上表現出最強抑制能力的菌株R1-6，雖然生物膜形成能力與R1-3沒有顯著差異，但其對根系分泌物的趨化性較弱，其根際定殖能力也相應較差，這很可能是其在盆栽試驗中防效不佳的原因。由此可見，生物膜形成能力相當的前提下，對根系分泌物趨化性強的菌株擁有更有效的根際定殖能力和對病害的實際防控能力。鑒于部分植物促生菌能夠有效利用根系分泌物從而實現根際定殖，崔曉雙等^[38]在根際促生菌的篩選工作中將菌株對根系分泌物競爭能力的強弱作為初篩標準，在一定程度上減少了工作量且篩選出對根系分泌物中的營養物質具有高競爭能力的菌株。本研究結果表明，可以將平板對峙試驗結果和根際定殖能力結合起來考量菌株特性，即把候選菌株對根系分泌物的趨化性和生物膜形成能力納入初篩標準，選擇綜合表現較好的生防菌株進行溫室生物學試驗驗證。

綜上，生防芽孢桿菌R1-3是一株有著較強根際定殖能力的多功能生防菌株，下一步將探索該菌的規?；囵B條件和田間防效，以期為開發防控甜瓜土傳病害的生物肥料及微生物制劑奠定基礎。

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（責任編輯：陳海霞）