外周血hsa_circ_0105035表達水平與急性缺血性腦卒中的相關性▲

梁雪瑩 趙 直 龍建雄 朱路路 楊佳磊 蘇 莉

(廣西醫科大學公共衛生學院,廣西南寧市 530021)

缺血性腦卒中是一種腦部供血障礙導致的腦組織壞死性疾病,約占全部腦卒中的80%,是全球死亡和殘疾的主要原因之一[1]。在時間窗內(發病4.5 h內)盡早給予靜脈溶栓,是缺血性腦卒中的有效療法。但由于時間窗狹窄,只有不到3%的缺血性腦卒中患者可以獲得有效的溶栓治療[2-3]。因此,迫切需要尋找能夠早期診斷和有效治療缺血性腦卒中的新策略。近期研究表明,環狀RNA(circular RNA,circRNA)參與缺血性腦卒中的發生發展[4-5],其中hsa_circ_0105035由切除修復交叉互補組4基因(excision repair cross complementation group 4, ERCC4)前體mRNA反向剪接形成,ERCC4在修復DNA損傷和維持基因組穩定性方面起重要作用[6]。ERCC4作為核苷酸切除修復途徑中的限速酶,可能在缺血性腦卒中的病理生理過程中起關鍵作用,其變異可能會增加缺血性腦卒中的風險[7],但目前尚未見有關hsa_circ_0105035與腦卒中關系的研究報道。本文旨在探討外周血hsa_circ_0105035表達水平與急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke, AIS)的關系,為AIS的防治策略提供新的依據?，F報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 納入、排除標準 (1)病例組納入標準:①缺血性腦卒中病例均符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的《各類腦血管病診斷要點》診斷標準,均經頭顱MRI和/或CT確診;②起病在72 h以內的AIS患者。排除標準:①腫瘤、心源性栓塞、腦外傷、腦血管畸形等其他原因引起的AIS;②自身免疫性疾病患者;③合并嚴重心、肝、腎功能障礙的患者;④依從性差、不合作而無法完成資料收集的患者。(2)對照組納入標準:無腦卒中、冠心病等心腦血管疾病史的社區人群。排除標準:①過去2周內有感染史;②依從性差而無法完成資料收集者。

1.1.2 研究對象來源 病例組來源于2015年12月至2021年9月在廣西中醫藥大學第一附屬醫院腦病科住院的AIS患者,共納入310例。對照組來源于同城區社區衛生服務中心每年定期體檢的無腦卒中、冠心病等心腦血管疾病史的社區人群,共納入310例。病例組年齡為(65.59±11.25)歲,對照組年齡為(67.22±6.98)歲,兩組研究對象的年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05)。所有對象均知悉研究內容,并簽署知情同意書。本研究已通過廣西醫科大學醫學倫理委員會審查批準。

1.2 方法

1.2.1 外周血標本采集與處理 利用含乙二胺四乙酸(ethylenediamintetra-acetic acid, EDTA)抗凝劑的真空采血管采集研究對象清晨空腹狀態下的外周靜脈血5 mL,病例組為入院次日采集,4℃、2 500 g離心15 min,分離血漿后加入紅細胞裂解液(北京艾德萊生物科技有限公司)于抗凝管中,充分裂解后分裝至2 mL離心管,4℃、13 000 g離心3 min,最后獲得白細胞團,加入1 mL TRIzol試劑(美國Invitrogen公司),渦旋震蕩,-80℃保存備用。

1.2.2 總RNA提取及實時熒光定量PCR 采用TRIzol試劑提取樣本總RNA,采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(日本TaKaRa公司),嚴格按照實驗說明對RNA進行cDNA合成。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成:hsa_circ_0105035的上游和下游引物序列(5′ to 3′)分別為ATATTTGGATACACAGGTCGGCC、TCGGTATGGTTAGAAGATATCCCAT;β-actin的上游和下游引物序列(5′ to 3′)分別為GTGGCCGAGGACTTTGATTG、CCTGTAACAACGCATCTCATATT;GAPDH的上游和下游引物序列(5′ to 3′)分別為GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT、GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG;U6的上游和下游引物序列(5′ to 3′)分別為GGAACGATACAGAGAAGATTAGC、TGGAACGCTTCA-CGAATTTGCG。使用SYBR PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(日本TaKaRa公司)進行PCR,然后通過Sanger測序確認PCR反應產物的剪接序列,驗證hsa_circ_0105035的環狀結構。以2-△CT公式計算hsa_circ_0105035的相對表達水平。

1.2.3 線性消化酶(RNase R)實驗 為了驗證hsa_circ_0105035的環狀結構,提取的RNA分為陰性對照組(MOCK組)和RNase R消化組,RNase R消化組按照1 μg RNA加入3U RNase R溶液(美國Epicentre公司)的標準配置線性消化反應體系,以37℃ 15 min,然后72℃ 10 min滅活酶活性,4℃ 5 min后保存收集樣本,隨后通過逆轉錄和qRT-PCR技術測定hsa_circ_0105035和GAPDH在兩組中的相對表達水平。

1.2.4 核質分離實驗 為了明確hsa_circ_0105035的亞細胞定位情況,本研究進行了核質分離實驗。按照PARISTM核質分離試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)的使用說明,收集了293T細胞的胞核和胞質RNA。以U6作為細胞核定位標志物,GAPDH作為細胞質定位標志物,通過qRT-PCR檢測細胞核和細胞質中U6、GAPDH、hsa_circ_0105035的相對表達水平。

1.3 腦梗死體積計算 本研究通過醫院的臨床病例信息系統收集了AIS患者的頭顱CT、MRI影像學資料。通過Image J軟件計算得到AIS患者腦梗死部位每張CT或MRI圖像的梗死面積,每張圖像層面厚度為5 mm,最終合并計算得到腦梗死體積。

1.4 臨床血液生化指標的檢測和分析 采用EDTA抗凝管采集AIS患者入院次日清晨的空腹外周靜脈血2 mL,使用邁瑞6900全自動血細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)檢測血常規指標。采用非抗凝采血管采集患者清晨空腹外周靜脈血2 mL,使用HITACHI日立7600全自動生化分析儀[日立(中國)有限公司]檢測心肌酶指標。

1.5 統計學分析 運用R軟件(R 4.0.5)進行統計學分析。符合正態分布的計量資料采用t檢驗,非正態的計量資料采用非參數檢驗。計數資料的組間比較采用χ2檢驗。非正態分布計量資料的相關分析采用Spearman秩相關。所有的檢驗均為雙側檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 hsa_circ_0105035的環狀結構驗證及亞細胞定位 將qRT-PCR產物進行Sanger測序,測序結果表明擴增產物為環狀RNA hsa_circ_0105035(圖1A)。RNase R消化后,RNA核酸凝膠電泳結果(見圖1B)。線性消化酶實驗結果顯示,與未加RNase R組相比,hsa_circ_0105035的表達量稍有降低,而GAPDH作為線性RNA參照,表達量明顯降低(圖1C)。核質分離實驗結果顯示,hsa_circ_0105035在細胞質和細胞核中均有表達,主要分布于細胞質中(圖2)。

圖1 hsa_circ_0105035環狀結構的驗證結果

圖2 hsa_circ_0105035在細胞中的分布情況

2.2 外周血hsa_circ_0105035表達水平比較 AIS患者外周血hsa_circ_0105035表達水平低于對照組,差異有統計學意義(Z=7.991,P<0.001),見圖3A。按性別分層分析結果顯示,男性AIS患者外周血hsa_circ_0105035表達水平低于男性對照(Z=5.570,P<0.001),女性AIS患者外周血hsa_circ_0105035表達水平也低于女性對照(Z=5.306,P<0.001)。見圖3B。

圖3 外周血hsa_circ_0105035表達水平比較

2.3 hsa_circ_0105035表達水平與AIS患者腦梗死體積的關聯 由于醫院新舊系統更換,本研究只收集到248例患者的頭顱CT、MRI影像學資料進行腦梗死體積計算。按照外周血hsa_circ_0105035表達水平的中位數,將AIS患者分為hsa_circ_0105035低表達組(n=124)和高表達組(n=124),結果顯示,與hsa_circ_0105035低表達組AIS患者相比,hsa_circ_0105035高表達組AIS患者的腦梗死體積更小(Z=2.293,P=0.022),見圖4A。Spearman相關分析結果顯示,AIS患者的外周血hsa_circ_0105035表達水平與腦梗死體積呈負相關關系(rs=-0.127,P=0.045),見圖4B。3例不同hsa_circ_0105035表達和腦梗死體積的AIS患者數據見圖5。

圖4 AIS患者外周血hsa_circ_0105035表達水平與腦梗死體積的關聯

圖5 3例AIS患者hsa_circ_0105035表達水平和腦梗死體積的代表性數據

2.4 hsa_circ_0105035不同表達水平AIS患者的臨床指標比較 hsa_circ_0105035低表達組AIS患者的血小板體積分布寬度、乳酸脫氫酶含量高于高表達組,而紅細胞體積分布寬度低于高表達組,差異均有統計學意義(均P<0.05)。兩組AIS患者白細胞計數、中性粒細胞數、淋巴細胞數等血常規指標及肌酸激酶、MB亞型肌酸激酶同工酶、α-羥丁酸脫氨酶比較,差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1、表2。

表1 hsa_circ_0105035不同表達水平的AIS患者血常規指標比較 (x±s)

表2 hsa_circ_0105035不同表達水平AIS患者的心肌酶指標比較 (x±s,U/L)

3 討 論

近年來,缺血性腦卒中的發病率呈逐年上升趨勢,造成了嚴重的社會和經濟負擔,因而迫切需要探尋缺血性腦卒中的有效防治手段[8]。本研究首次報道hsa_circ_0105035在AIS患者外周血中表達下調,其表達水平與腦梗死體積呈負相關,而且與血小板體積分布寬度、乳酸脫氫酶等參數相關,為AIS的病情評估和疾病預測提供潛在的參考價值。

circRNA是一類不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾巴的閉合環狀RNA分子[9],這一特質使得circRNA能夠耐受線性RNA消化酶的消化,具有更高的穩定性和更長的半衰期[10]。本研究通過線性RNA消化酶實驗觀察到hsa_circ_0105035的表達穩定性明顯高于線性RNA,并通過PCR產物測序明確引物的特異性以及對hsa_circ_0105035的特異性擴增。我們最終證實hsa_circ_0105035是一個環狀RNA分子,為后續研究的開展提供了嚴謹的基礎。我們還通過核質分離實驗明確了hsa_circ_0105035主要分布于細胞質,為后續功能和機制的研究指明了探索的方向。

近年研究發現,circRNAs在哺乳動物大腦組織中的表達豐度遠高于其他組織,circRNAs可能參與缺血性腦卒中等神經系統疾病的病理生理過程[11]。Jiang等[12]報道缺氧缺血性腦損傷后大鼠海馬體中circRNA表達譜發生改變。另有體內實驗結果顯示,過表達的circFOXP1能減輕小鼠神經功能缺損和縮小腦梗死體積,并通過調節STAT3/凋亡信號來緩解腦缺血后的腦損傷[13]。近年研究表明,circRNAs與缺血性腦卒中的發生密切相關。Wu等[14]研究發現circTLK1在小鼠缺血性腦組織和AIS患者血漿中表達升高,并且敲低circTLK1能夠減少缺血性神經元損傷、改善神經功能缺損。Peng等[15]報道,circRNA HECTD1的表達與AIS的發病風險、嚴重程度和復發相關。但有關hsa_circ_0105035與缺血性腦卒中關系的研究尚未見報道,值得我們去探索和研究。hsa_circ_0105035是由ERCC4基因反向剪接形成的環狀RNA。本研究發現hsa_circ_0105035在AIS患者外周血中表達下調,提示其可能影響AIS的發生發展。缺血性腦卒中發生后不久,會在大腦的多種細胞中引起DNA氧化損傷,同時細胞也會通過誘導內源性DNA修復機制來對抗DNA損傷的積累,其中就包括核苷酸切除修復途徑[16]。有研究發現,ERCC4是核苷酸切除修復途徑中必不可少的基因[17]。ERCC4作為核心的DNA核苷酸切除修復酶,在發生DNA氧化損傷后被激活,從而參與DNA損傷修復過程[18-19]。有研究報道大鼠腦缺血/再灌注后缺血區神經元凋亡與DNA修復酶活性下降有關[20]。何偉[21]也發現DNA損傷修復基因XRCC1 rs25487位點A等位基因可能是中國南方漢族人群缺血性腦卒中發病的獨立保護因素。Ma等[7]發現,ERCC4基因可能在缺血性腦卒中的病理生理過程中發揮重要作用,其變異可能會增加缺血性腦卒中的發生風險。另有研究[22]報道,circRNA可以促進其親本基因的轉錄并轉化為肽,我們推測hsa_circ_0105035是否可以通過調控其親本基因ERCC4來參與缺血性腦卒中的病理生理過程,這有待于下一步的探索。

AIS患者的腦梗死體積和神經功能缺損程度是判斷病情嚴重程度的重要指標,腦梗死體積較大者更容易發生偏癱、意識障礙,甚至危及生命[23-24]。在疾病早期盡快判斷AIS患者腦梗死體積有助于臨床制訂個體化的診療方案,改善患者病情。氧化應激和炎癥反應等多種破壞性機制是引起神經元損傷的原因[25]。在腦卒中患者中,神經元損傷與腦梗死體積相關,能夠縮小腦梗死體積的治療通常也能夠減輕神經元損傷[26-27]。Wu等[14]研究發現,circTLK1在AIS患者血漿中表達上調,與腦梗死體積呈正相關關系;在小鼠腦卒中模型中敲低circTLK1可顯著縮小腦梗死體積,減輕神經元損傷。Li等[28]觀察到大動脈粥樣硬化型缺血性腦卒中患者外周血的hsa_circ_0001599表達上調,與腦梗死體積呈正相關。Yang等[5]發現circUSP36在缺血性腦卒中患者外周血中顯著降低,其表達水平與腦梗死體積呈負相關。與上述研究一致。本研究也發現在AIS患者外周血hsa_circ_0105035水平與腦梗死體積呈負相關。目前缺血性腦卒中的診斷主要依靠影像學檢查,但卒中往往在初始發作時無法識別,MRI可能無法發現AIS患者潛在或微小的梗死病變。我們的研究發現可以為缺血性腦卒中早期的病情評估和疾病預測提供潛在的參考價值。

此外,circRNA還被報道與AIS相關的多種臨床特征存在相關性[29]。在AIS患者中,表達上調的circHECTD1與C反應蛋白和多個促炎細胞因子水平呈正相關[15]。而AIS患者外周血中表達下調的circDLGAP4與C反應蛋白水平和多個促炎細胞因子水平呈負相關[30]。一般來說,在患者中表達上調的circRNA是疾病的風險因素,并與部分疾病促進因子呈正相關,而在患者中表達下調的circRNA則相反。我們的研究也發現在hsa_circ_0105035高表達組AIS患者中血小板體積分布寬度、乳酸脫氫酶含量降低。此前已有報道,血小板體積分布寬度可能參與了AIS的發生發展過程,并對疾病的嚴重程度有一定的影響[31]。臨床研究發現,缺血性腦卒中患者的血小板體積分布寬度越大,病情越嚴重[32-33]。臨床上已經發現缺血性腦卒中患者的血清和腦脊液中乳酸脫氫酶水平升高,與腦卒中發生有關[34]。還有研究發現急性腦卒中患者的腦脊液乳酸脫氫酶水平可以反映腦損傷的嚴重程度[35]。hsa_circ_0105035與血小板體積分布寬度、乳酸脫氫酶的關聯也進一步表明了hsa_circ_0105035可能作為一個保護因素在AIS病理生理過程中發揮作用。

綜上所述,我們首次揭示hsa_circ_0105035可能與AIS的發生相關,并且與AIS患者的腦梗死體積存在關聯,可以為缺血性腦卒中早期的病情評估和疾病監測提供潛在的預測價值。本研究僅采集了AIS患者入院次日的血液樣本,并未收集治療后的樣本以比較hsa_circ_0105035的表達差異對腦梗死體積及病情嚴重程度的影響,這也是我們未來的研究可以進一步探索的方向,從而促進缺血性腦卒中防治。