鵝掌瘋醋劑對抗白色念珠菌及其早期生物膜的體外實驗研究

林 琳,劉濤峰

(1.安徽中醫藥大學研究生院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科,安徽 合肥 230031)

鵝掌風,好發于手掌,因風毒或濕邪侵于皮膚所致,反復發作后皮膚增厚,枯槁干裂,宛如鵝掌[1],西醫稱為“手癬”;若發于足部則稱為“足癬”,中醫稱為“腳濕氣”。該病主要是由紅色毛癬菌、須癬毛癬菌等癬菌引起,但近年來白色念珠菌及其他酵母樣真菌的感染率逐漸上升[2]。該病常伴瘙癢,搔抓后加劇,西醫常用唑類藥物治療,效果顯著,但容易復發,嚴重影響患者身心健康和正常生活。

鵝掌瘋醋劑,又名鵝掌風醋浸劑,是安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑(注冊號:Z20050075),臨床應用已近30年,是皮膚科常用于治療手足癬的外用抗真菌藥。研究[3]表明,鵝掌瘋醋劑對多種細菌及真菌具有良好的抑制作用,但其機制不詳。本研究選用白色念珠菌為實驗對象,探討鵝掌瘋醋劑在體外對白色念珠菌及早期生物膜的抑制作用及其機制,為鵝掌瘋醋劑在臨床上治療真菌性疾病提供實驗依據。

1 材料

1.1 菌株 白色念珠菌SC5314由安徽中醫藥大學中西醫結合學院汪長中教授惠贈。

1.2 藥物與試劑 鵝掌瘋醋劑由安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心提供。酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)培養基和沙氏葡萄糖液體(Sabourauddextrose broth, SDB)培養基均由杭州百思生物技術有限公司生產。瓊脂粉:北京鴻潤寶順科技有限公司;磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline, PBS):太原市羅塞塔石生物技術有限公司;戊二醛:上海遠慕生物科技有限公司;鋨酸:上海哈靈生物科技有限公司;醋酸雙氧鈾:西安鼎天化工有限公司;檸檬酸鉛:德國默克化工技術有限公司;營養肉湯:中山市百微生物技術有限公司;甘露醇:天津市登峰化學試劑廠;KH2PO4:國藥集團化學試劑有限公司;細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8):福州飛凈生物科技有限公司。

沙氏瓊脂(sabourauds, SDA)培養基:取配好的SDB培養基1 000 mL,加入瓊脂粉20 g,高壓滅菌后倒板備用。

Spider固體培養基:稱取營養肉湯10 g、甘露醇10 g、2 g的KH2PO4、瓊脂粉20 g,溶解于少量的蒸餾水中,并調節pH值為7后定容至1 000 mL,高壓滅菌后置于4 ℃保存備用。

1.3 儀器 高速離心機(型號JW-3021HR):安徽嘉文儀器裝備有限公司;紫外分光光度計(型號photoLab 7600):德國WTW;光學顯微鏡(型號IX-71):日本奧林巴斯有限公司;多功能酶標儀:美國賽默飛世爾科技公司;掃描電子顯微鏡(型號GeminiSEM 500):德國蔡司公司;透射電子顯微鏡(型號JEM-2100F):日本電子株式會社。

2 方法

2.1 白色念珠菌菌懸液的配制 挑取白色念珠菌于SDA培養基中活化后,取較大菌落接種到SDB培養基中,置于37 ℃恒溫培養箱中,120 r/min震蕩培養24 h。用血細胞計數板計數確定菌懸液濃度范圍,并調整孢子菌懸液的濃度至(1～5)×106CFU/mL。

2.2 微量稀釋法測量鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC) 參照美國臨床和實驗室標準協會標準[4],采用微量稀釋法測量鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌的MIC,對應稀釋倍數分別為原液濃度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1 024。

2.3 細胞外紫外物質吸收的變化 實驗組取制備好的白色念珠菌菌懸液3 mL與鵝掌瘋醋劑(MIC)3 mL混合,對照組取白色念珠菌菌懸液3 mL不作處理,培養10 min后離心,取上清液,立即用紫外分光光度計測定波長為260 nm下的吸光度值[5]。

2.4 掃描電子顯微鏡觀察白色念珠菌表面結構 實驗組取制備好的白色念珠菌菌懸液3 mL與鵝掌瘋醋劑(MIC)3 mL混合,對照組取白色念珠菌菌懸液3 mL不作處理,培養10 min后離心,洗滌3次,棄上清液,用2.5%戊二醛固定過夜后洗滌3次,乙醇梯度脫水,鍍金后通過掃描電子顯微鏡觀察拍照[6]。

2.5 透射電子顯微鏡觀察白色念珠菌超微結構 實驗組取制備好的白色念珠菌菌懸液3 mL與鵝掌瘋醋劑(MIC)3 mL混合,對照組白色念珠菌菌懸液3 mL不作處理,培養10 min后離心洗滌3次,棄上清液,用2.5%戊二醛固定過夜后洗滌3次,并用1%鋨酸固定2 h后洗滌3次,乙醇梯度脫水,環氧樹脂包埋切片,以鈾鉛雙染色在透射電子顯微鏡下觀察拍照[7]。

2.6 CCK-8試驗測定白色念珠菌生物被膜形成早期黏附性 取100 μL制備好的菌懸液接種于96孔板中,37 ℃培養,分別培養1、2、3、4 h后吸棄培養基及未黏附菌,PBS洗滌3次,實驗組加入鵝掌瘋醋劑(MIC)100 μL,對照組白色念珠菌菌懸液不作處理,37 ℃培養24 h,在各孔中加入CCK-8溶液,避光培養箱37 ℃孵育2 h,450 nm處檢測吸光度值,每組設8個復孔[8-9]。

2.7 芽管形成試驗觀察白色念珠菌芽管形成的情況 實驗組取制備好的白色念珠菌菌懸液3 mL與鵝掌瘋醋劑(MIC)3 mL混合,對照組取白色念珠菌菌懸液3 mL不作處理,培養10 min后,各取100 μL涂布于Spider固體培養基,37 ℃培養24 h,光學顯微鏡觀察菌絲生成情況并拍照[10]。

3 結果

3.1 鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌的MIC 鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌的MIC為藥物原濃度的1/16,提示其具有一定的抗真菌能力。

3.2 鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌細胞外紫外物質吸收的影響 對照組測得白色念珠菌細胞外的紫外吸收物質含量為(3.727±0.002),實驗組測得白色念珠菌細胞外的紫外吸收物質含量為(5.155±0.011),與對照組比較,實驗組白色念珠菌細胞外的紫外吸收物質顯著升高(P<0.05)。

3.3 鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌表面結構的影響 利用掃描電子顯微鏡觀察白色念珠菌的表面結構,結果發現,對照組白色念珠菌細胞呈現圓形或橢圓形,菌體飽滿,細胞表面光滑。經過鵝掌瘋醋劑處理的白色念珠菌部分菌體細胞表面粗糙、皺縮、萎陷、細胞質內容物滲漏,很難發現形態正常的菌體細胞。見圖1。

注:A.對照組;B.實驗組圖1 掃描電子顯微鏡觀察鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌表面結構的影響(×10 000倍)

3.4 鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌超微結構的影響 對照組白色念珠菌有正常完整的細胞結構,呈圓形或橢圓形,細胞壁、細胞膜光滑,層次完整清晰,細胞內其他部分密度均勻。經過鵝掌瘋醋劑處理的菌體損傷比較重,視野中異常的真菌居多,受到損傷細胞的細胞壁受損,呈現扭曲和不規則的形狀,細胞膜被破壞,細胞核破裂,細胞器溶解,細胞質成碎渣樣。見圖2。

注:A.對照組;B.實驗組圖2 透射電子顯微鏡觀察鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌超微結構的影響(×20 000倍)

3.5 鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌生物被膜形成早期黏附性的影響 對照組相當于CCK-8試驗中的空白組,默認其早期黏附性為0。與對照組比較,實驗組白色念珠菌早期(1、2、3、4 h)生物膜的黏附率均明顯受到抑制(P<0.05),且與其他3個時間點比較,鵝掌瘋醋劑對培養了1 h的生物膜的抑制作用最弱。見圖3。

注:與1 h組比較,*P<0.05圖3 鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌早期(1、2、3、4 h)生物膜組織表面黏附率的影響

3.6 鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌芽管形成的影響 光學顯微鏡觀察顯示,對照組白色念珠菌為大量的酵母相細胞和菌絲相細胞,菌絲交織,密度高;實驗組白色念珠菌大部分是酵母相細胞,僅有少量菌絲期細胞,且菌體密度明顯降低。見圖4。

注:A.對照組;B.實驗組圖4 光學顯微鏡觀察鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌芽管形成的影響(10×10倍)

4 討論

鵝掌風名稱首見于明代沈之問《解圍元藪》[11]。中醫認為其多因感受風毒,凝結皮膚,氣血失養所致,發為風濕毒聚證,用祛風除濕、殺蟲止癢治法;或久病化燥傷陰,肌膚失去陰血濡養而干燥、脫屑,甚則皸裂,發為血虛風燥證[12],用養血潤燥、祛風止癢治法[13]。該病病位雖在皮膚,卻內連臟腑,累及心、脾胃、腎,如《醫宗金鑒·外科心法要訣·鵝掌風》所言:“此證生于掌心……余毒未盡,又兼血燥,復受風毒,凝滯而成?！?/p>

鵝掌瘋醋劑的主要成分為土荊皮、百部、大黃、苦參、黃柏、川椒。該制劑具有清熱解毒、殺蟲止癢、軟堅潤燥的功效,一般為外用,主要用于鵝掌風的治療[14]。使用方法為將患處充分浸泡在藥液中至少10 min,10 d為1個療程。土荊皮有祛風除濕、殺蟲止癢之功,其有機酸、乙醇浸膏及苯浸膏對常見的10種致病真菌均有一定的抗菌作用[15]。百部有潤肺下氣止咳、殺蟲滅虱之功,現代藥理實驗結果表明其能抗病原微生物[16],抗寄生蟲等。

念珠菌對抗真菌藥物的特異性靶點相對于其他真菌類較少,實驗證明目前抗真菌藥物的作用于白色念珠菌的靶點來說主要有以下3個方面:抑制細胞膜成分麥角甾醇合成,為三唑類藥物和多烯類藥物的作用;抑制細胞壁成分β-1,3-葡聚糖合成,為棘白菌素類藥物的作用;抑制核酸合成[17]。

正常情況下,只有直徑不超過1 nm的小分子可以通過真菌細胞壁的微孔。當菌體結構遭到了藥物作用的損壞,細胞通透性改變,細胞內具有紫外吸收特性的大分子物質也由細胞內泄露到細胞外[18]?；ń?、土荊皮和黃連等單味中藥具有黃酮類、生物堿類、有機酸類、皂苷類和揮發油類化合物等主要活性成分,能夠有效抑制白色念珠菌活性[19],原因可能與其能夠破壞真菌菌體的膜結構,改變菌體滲透性有關[20-21]。本研究發現,鵝掌瘋醋劑能破壞白色念珠菌的細胞壁或細胞膜,影響菌體滲透性,使細胞內容物漏出,導致白色念珠菌的死亡。

電子顯微鏡觀察顯示,鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌的生長有明顯的抑制作用,且觀察發現菌體的細胞壁、細胞膜破損,細胞質產生凝聚,細胞核破裂,細胞器溶解,且細胞表面還有一層電子密度高的絮狀物質,可能是細胞內物質外泄,表明鵝掌瘋醋劑可以破壞念珠菌的菌體結構。而這種破壞菌體結構的抗菌方式,與傳統的抗真菌藥物不同,故不易引起耐藥性[22]。研究[23-24]發現,復方中藥藥方厚樸煎劑和三黃苦參湯對真菌的體外抗菌方式均可能與破壞菌體結構有關。

念珠菌黏附宿主表面的能力是感染期間成功定殖和持久的先決條件[25]。CCK-8是一種高靈敏度、非放射性的比色法,可用于細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等實驗,較傳統MTT法更有優勢[26]。CCK-8法檢測發現,鵝掌瘋醋劑浸泡白色念珠菌生物被膜細胞后,白色念珠菌表面黏附性明顯降低,說明鵝掌瘋醋劑可以降低生物被膜的黏附性,從而抑制早期生物膜的形成,降低白色念珠菌對宿主的定殖能力,減少感染宿主的機會。與其他3個時間點比較,鵝掌瘋醋劑對培養了1 h的白色念珠菌早期生物膜表面黏附性抑制率較低,可能與白色念珠菌在生長周期的早期生長速度更快有關,后期抑制率逐漸升高并趨于平穩。

白色念珠菌的形態轉化是病原體感染宿主機制的核心,酵母相細胞參與附著和傳播,而菌絲相使念珠菌更具侵入性,能更有效地滲透和附著在宿主組織上[18],并形成成熟的生物膜以逃避宿主免疫細胞的吞噬,這對宿主感染的致病機制至關重要[27-28]。酵母相細胞黏附在宿主表面,菌絲大量生產,并且分泌細胞外基質,最終形成結構致密的成熟網狀生物膜[29]。念珠菌成熟的生物膜的形成會增加其對抗真菌藥物的耐藥性,造成了念珠菌病患者較高的死亡率,目前針對念珠菌生物膜的藥物的敏感性仍然很低[29]。本研究通過光學顯微鏡觀察到鵝掌瘋醋劑能夠抑制白色念珠菌菌絲形成,降低芽管的形成能力,抑制白色念珠菌的形態轉化,并能有效抑制早期生物被膜的生成。

綜上所述,鵝掌瘋醋劑對白色念珠菌MIC值為藥物原濃度的1/16,有一定的抗真菌能力,其作用機制可能是通過改變菌體滲透性,破壞菌體的正常結構,抑制生物被膜早期黏附性和芽管的形成而有效抑制生物被膜的生成,從而發揮抗真菌的作用。