黑老虎內生真菌及根際土壤真菌的群落結構與生態功能分析

劉濤 馬楠 金吉芬 彭志軍 李興忠 汪得凱

摘 要： 為探討黑老虎（Kadsura coccinea）根際土壤和組織內生真菌菌群的組成及其生態功能，該研究采用ITS高通量測序技術對成熟黑老虎（根、莖、葉）內生真菌及根際土壤真菌群落結構、多樣性和生態功能進行了分析。結果表明：（1）從12個樣品中共獲得2 241個可操作分類單元（OTU），涉及10門、41綱、95目、212科、367屬，內生真菌（根、莖、葉）和根際土壤真菌OTU數分別為386、536、258、1 435個，其中共有的OTU為18個。在門水平上，黑老虎內生真菌及根際土壤真菌優勢群落均為子囊菌門和擔子菌門，其中子囊菌門在葉和莖中占比分別高達96.99%和95.37%；在屬水平上，黑老虎根際土壤真菌中腐生真菌被孢霉屬占比較高（為13.5%），葉和莖等生長旺盛的組織中子囊菌門未分類屬和痂囊腔菌屬占比較高。（2）α多樣性分析結果顯示，黑老虎根際土壤真菌群落的豐度和多樣性明顯高于內生真菌，莖中內生真菌豐度顯著高于根和葉，而根、莖和葉組織間內生真菌多樣性差異不顯著；PCoA分析結果顯示，葉和莖的真菌群落結構相似性更高。（3）利用FUNGuild數據庫進行的功能預測分析結果顯示，黑老虎根際土壤真菌和內生真菌含有大量的未分類菌群；功能已分類菌群中，病理寄生型功能群在生長旺盛的組織中占比較高。該研究結果為黑老虎優異功能菌的篩選和發掘提供了理論依據。

關鍵詞： 黑老虎， 高通量測序， ITS， 內生真菌， 根際土壤真菌， 多樣性， FUNGuild

中圖分類號： Q945.8? 文獻標識碼： A? 文章編號： 1000-3142（2023）05-0869-11

Abstract： To investigate rhizosphere soil and endophytic fungal community structure， diversity， and ecological function in Kadsura coccinea， the endophytic fungal communities from roots， stems， leaves， and rhizosphere soils of mature K. coccinea were analyzed based on ITS high-throughput sequencing technology. The results were as follows：（1） A total of 2 241 operational taxonomic units （OTUs） were obtained from 12 samples at 97% of sequence homology level. The OTUs of endophytic （root， stem and leaf） and rhizosphere soil fungi were 386， 536， 258 and 1 435， respectively， of which 18 OTUs were in common. They belonged to 10 phyla， 41 classes， 95 orders， 212 families and 367 genera. The dominant fungal communities at the phylum level in the endophytic and rhizosphere soil of K. coccinea were Ascomycota and Basidiomycota. Among them， Ascomycota accounted for 96.99% and 95.37% of the endophytic fungal community in leaves and stems， respectively. At the genus level， the saprophytic fungi Mortierella accounted for a relatively high proportion （13.5%） in the rhizosphere soil. In contrast， pathogenic fungi such as Ascomycota_unclassified and Elsinoe were mainly found in vigorously growing tissues （leaves and stems）. （2） Alpha diversity analysis showed that the richness and diversity of the fungal community in the rhizosphere soil of K. coccinea were significantly higher than those in endophytic fungi. Although the abundance of endophytic fungi in stems was significantly higher than that in roots and leaves， the differences in endophytic fungal diversity among roots， stems and leaves were not significant. The principal component analysis （PCoA） revealed that the fungal community structures of leaves and stems were more similar， and those of roots and rhizosphere soils were more similar. （3） The function of fungal communities in different tissues and rhizosphere soils of K. coccinea was predicted and analyzed by using FUNGuild platform. The results showed that the rhizosphere soil fungi and endophytic fungi contained a large number of unclassified fungi. Among the functionally classified fungi， the pathotroph functional group had a higher proportion in the vigorously growing tissues. This study provides a theoretical basis for the screening and exploring of active functional fungi in K. coccinea.

Key words： Kadsura coccinea， high-throughput sequencing， ITS， endophytic fungi， rhizosphere soil fungi， diversity， FUNGuild

黑老虎（Kadsura coccinea），別名冷飯團、臭飯團、布福娜等，是木蘭科南五味子屬植物（林祁和楊志榮，2007），主要分布于我國湖南、貴州、云南、福建、廣西、四川、江西等地（曾建飛，1996），以根、莖入藥，具有行氣活血、消腫止痛等功效（Wang et al.， 2012）?，F代藥理學研究表明，黑老虎提取物具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、保肝護肝及抗癌等功能（Sun et al.， 2009；Zhao et al.， 2014；Zhao et al.， 2021）。黑老虎果實富含木脂素、氨基酸、花青素等活性物質（舒永志等，2012；趙林峰和梁忠厚，2019），已作為一種新興水果逐漸為人們所熟知，在貴州黔東南、湖南通道及湖北恩施等地作為脫貧致富產業得以推廣（劉濤等，2009；高漸飛等，2022）。

植物內生菌分布于植物組織表面或器官內部，與寄主植物長期依存并協同進化（Rodriguez et al.， 2009；Porras-Alfaro & Bayman， 2011）。植物內生真菌可以促進植物的生長發育、抵御非生物脅迫、增加宿主的抗病性，部分藥用植物內生真菌可產生與寄主類似的次生代謝物，廣泛應用于醫學、農學、工業及生物技術等領域（Khan et al.， 2012；Liu et al.， 2018；Juri c＇ et al.， 2020）。目前，藥用植物內生菌研究較多，如杜仲（楊娟等，2019）、重樓（王艷等，2019）、掌葉大黃（Chen et al.， 2021）、黃精（樊銳鋒等，2021）等。有研究表明，五味子科植物中含有豐富的內生真菌，已分離的內生菌具有抗氧化（趙玥等，2015）、拮抗植物病原菌（潘爭艷等，2007；張譽薺等，2021）和抑制病原菌（張譽薺等，2020）、抑制腫瘤細胞生長（Song et al.， 2021）等功能。從五味子科植物中陸續分離了一些能夠產生木質素類或轉化宿主主要次生代謝物黑五味子酸的內生真菌（Wang et al.， 2017；毛瑞華和竇智，2019；Qin et al.， 2019， 2020）。然而，五味子科植物長期種植會導致土壤菌群發生變化。江林春等（2020）用高通量測序方法分析了未種植華中五味子（CK）與種植3 a（Y3）、6 a（Y6）后根際土壤化學性質和真菌群落變化規律，發現華中五味子種植6 a后根際土壤養分狀況和土壤真菌群落發生了明顯改變。這為五味子屬植物內生真菌及根際真菌的研究提供了重要信息，但對黑老虎內生真菌和根際真菌的研究報道還很少。

鑒于黑老虎內生真菌和根際真菌的研究現狀，本研究采用Illumina高通量測序方法，以多年生成熟的黑老虎為對象，通過分析黑老虎內生真菌及根際土壤真菌的真菌群落組成、多樣性和功能預測，探討以下問題：（1）黑老虎植株內生真菌和根際土壤真菌的群落組成差異和優勢菌群；（2）黑老虎內生真菌和根際真菌功能差異及形成原因。本研究為黑老虎內生真菌和根際真菌菌群的發掘和代謝活性產物的進一步研究提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

黑老虎根際土、根、莖和葉均采自貴州省果樹科學研究所試驗基地，品種資源編號為GZ1，已種植5 a以上。2021年11月采收黑老虎果實后，選取長勢一致、發育良好的成熟根、莖和葉，每3株混合作為1個處理，重復3次。根部帶土，置于冷鏈箱內，迅速帶回實驗室，將根部土壤抖落，留存無法抖落的為根際土壤，將根際土壤收集于無菌PE管中，根樣品標記為RT1、RT2和RT3，莖樣品標記為ST1、ST2和ST3，葉樣品標記為LF1、LF2和LF3，根際土樣品標記為Rh1、Rh2和Rh3。根和根際土樣品的制備參照王艷等（2019）的方法，將黑老虎根、莖和葉用流動的自來水沖去表面多余的根際土后，先分別置于75%乙醇中處理2 min，再用5%次氯酸處理3 min，最后用無菌水清洗3次，最終獲得表面無菌的黑老虎根、莖和葉樣品，由于難以從黑老虎肉質葉片中提取DNA，因此將表面滅菌的葉片放入無菌小網袋中，先置于變色硅膠中干燥24 h，再置于液氮中速凍用于后續DNA提取。

1.2 ITS文庫構建及高通量測序

根、莖和葉組織樣品經液氮研磨后，用植物基因組DNA試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號：DP305）提取總DNA， 根際土樣品用液氮研磨后提取土壤微生物DNA，使用FastDNA SPIN Kit for Soil 試劑盒（ MP Biomedicals，LLC，Ail，Ohio，貨號：116560200），提取步驟按照試劑盒說明書進行。ITS擴增子采用通用引物fITS7/ITS4（ITS2區）進行PCR擴增，所用的引物序列為fITS7（5′-GTGARTCATCGARTCTTTG-3′），ITS4（5′- TCCTCC

GCTTATTGATATGC-3′），PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增體系為25 μL，含2 × Phanta Max Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號：P515-01）12.5 μL，正向引物fITS7（1 μmol·L-1）和反向引物 ITS4（1 μmol·L-1）各2.5 μL，模板DNA 50 ng。 PCR程序： 95 ℃預變性5 min； 95 ℃變性30 s， 50 ℃退火30 s， 72 ℃延伸40 s，30個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳確證，PCR產物回收純化后，利用Illumina Mi Seq PE300平臺上機測序（杭州聯川生物科技公司，杭州）。

1.3 數據處理和分析

測序獲得的原始數據去除接頭序列后，使用FLASH V1.2.7軟件進行拼接，利用Trimmomatic V0.33軟件過濾低質量的測序堿基，利用Vsearch V2.3.4軟件過濾掉嵌合的reads獲得高質量的數據后，使用UPARSE軟件（http：//drive5.com/uparse/）在97%的相似水平下聚類生成OTU并進行注釋。利用QIIME 2軟件進行α、β多樣性分析（Bolyen et al.， 2019）。方差分析和多重比較采用SPSS 26.0軟件進行。繪圖用R V3.5.2軟件完成。內生真菌的生態功能利用FUNGuild平臺進行分析（Nguyen et al.， 2016）。

2 結果與分析

2.1 內生真菌和根際土壤真菌群落測序數據統計

對黑老虎的3個不同組織及根際土共計12個樣品進行ITS高通量測序，共測得1 023 870對讀長（reads），原始下機數據經雙端拼接、質量控制、嵌合體過濾后，進行高質量數據統計，共獲得988 991對有效reads，樣品有效reads為78 302～84 135對，每個樣品平均82 416對reads，有效率在94.79%～98.40%之間，Q20全部為98.98%及以上（表1），表明測序質量評價各項指標均符合ITS測序要求。內生真菌及根際土樣本的稀釋曲線均表現為先急劇上升，之后隨著測序條數的增加曲線趨于平緩，文庫的覆蓋度均在99.9%以上（圖1），表明各樣品物種測序量趨于飽和，測序結果可以充分覆蓋樣品的物種。另外，從樣品稀釋曲線來看，根際土壤真菌豐度遠大于內生真菌，提示根際土壤真菌多樣性可能比內生真菌更高。

2.2 內生真菌和根際土壤真菌群落OTU分析

經過分析和聚類，從12個樣品中共得到2 241個OTU，其中從根際土壤樣品中檢測到1 435個，從根、莖和葉3個組織樣品中分別檢測到386、536、258個。通過韋恩圖分析發現，根際土壤真菌和內生真菌群落中共有的OTU數量為18個，其中根際土中擁有較多獨立的OTU（為1 192個），而根、莖和葉組織中獨立的OTU數分別為151、383、112個。根際土和根中共有的OTU數量為195個，根際土與莖、葉共有OTU分別為65、52個，根、莖和葉3個組織共有OTU為40個（圖2）。圖2結果表明，盡管所檢測的OTU數量較多，但根際土和各組織間共有的OTU只有18個，占比僅0.8%，根際土壤真菌、組織內生真菌中形成了相對獨立的真菌群落。根際土壤與根共有的OTU占比相對較高（8.8%），提示黑老虎根長期生活在土壤中，可能與根際富集的真菌形成一定的互作關系，真菌群落之間產生相互影響。

2.3 內生真菌和根際真菌的群落結構組成

進一步將OTU的代表序列在門和屬水平上進行群落組成分析。在門水平上，根際土壤真菌和內生真菌的優勢群落均為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），其中子囊菌門占絕對優勢，根際土和根占比分別為57.26%和58.76%，而葉和莖占比分別高達96.99%和95.37%。此外，根中優勢菌門為擔子菌門和球囊菌門（Glomeromycota），分別占比為21.03%和17.96%，球囊菌門在莖、葉組織和根際土中分別占比為0.044%、0.004%和0.670%。接合菌門（Zygomycota）在根際土中占比為13.84%，在其他植物組織中占比為0.03%～1.31%（圖3：A）。未分類的OTU門在根際土中占比為13.66%，在植物組織中占比為0.19%～0.93%。

在屬水平上，黑老虎內生真菌和根際土壤真菌主要分布于367屬。其中，根際土壤真菌相對含量前5的有未分類真菌（Fungi_unclassified，13.7%）、被孢霉屬（Mortierella，13.5%）、小不整球殼（Plectosphaerella，6.0%）、錐囊菌屬（Subulicystidium，4.5%）和新叢赤殼屬（Neonectria，4.3%）；根中占比前5的屬有蠟殼耳目未分類屬（Sebacinales_unclassified，19.7%）、外瓶霉屬（Exophiala，15.2%）、球囊菌門未分類屬（Glomeromycota_unclassified，12.1%）、刺盾炱目未分類屬（Chaetothyriales_unclassified，8.8%）和鐮刀菌屬（Fusarium，8.0%）；莖中占比前5的屬為子囊菌門未分類屬（Ascomycota_unclassified，17.7%）、格孢腔菌目未分類屬（Pleosporales_unclassified，16.3%）、痂囊腔菌科未分類屬（Elsinoaceae_unclassified，11.8%）、橫斷孢屬（Strelitziana，9.1%）和Trichomeriaceae未分類屬（Trichomeriaceae_unclassified，8.6%）； 葉中痂囊腔菌屬（Elsinoe，21.5%）、球腔菌屬（Mycosphaerella，18.2%）、球座菌屬（Guignardia，14.2%）、間座殼屬（Diaporthe，6.9%）、瓶霉菌屬（Phialophora，5.4%）相對含量位于前5。這表明黑老虎根內生真菌及根際土真菌群落存在組織特異性，黑老虎根際真菌和內生真菌分別有特異的屬，根際土壤真菌和內生真菌菌群結構存在多樣性（圖3：B）。對黑老虎根際真菌和內生真菌測序所得的OTU結果在屬水平上進行分類及相對豐度信息繪制熱圖（heat map）進行分析，對根際真菌和內生真菌在門和屬水平上前30的物種進行聚類分析，在門水平上，莖和葉可以聚為一類（圖4：A）。在屬水平上，根際土與根聚為一類，莖和葉聚為一類（圖4：B）。結果顯示黑老虎根樣品和根際土樣品的真菌群落結構更相似，根際土壤真菌和根內生真菌群落之間可能存在相互影響，而莖和葉的內生真菌群落來源相近或可能存在相互作用。

2.4 內生真菌和根際土壤真菌群落的多樣性分析

ACE指數及Chao1指數反映物種豐度，Shannon指數和Simpson指數主要反映物種的多樣性。由表2可知，黑老虎根際土壤真菌群落豐度和多樣性顯著高于內生真菌，與內生真菌相比，根際土壤真菌群落的ACE指數、Chao1指數和Shannon指數均顯著高于內生真菌（P<0.05）。根、葉和莖的ACE指數及Chao1指數無顯著差異（P>0.05），而莖與葉的ACE指數及Chao1指數有顯著差異（P<0.05）。以上結果表明根際土壤真菌的豐度和多樣性高于內生真菌，莖中內生真菌的豐度顯著高于葉，根、莖和葉各組織間的多樣性差異不顯著。

為分析黑老虎根際土壤真菌群落和內生真菌群落之間的物種差異性，利用主坐標（principal coordinates analysis，PCoA）分析了黑老虎內生真菌和根際土壤真菌的結構情況，基于非加權距離矩陣（unweighted distance matrix），圖5結果顯示，第一主軸解釋了OTU水平真菌群落結構變化的32.44%，第二主軸解釋了OTU水平真菌群落結構變化的16.11%，兩個主軸合計解釋了48.55%真菌群落結構變化。PCoA分析結果顯示，在根際土壤和3種組織中，不同組織樣品間明顯分開，葉樣品與莖樣品相對聚集，而葉樣品與莖樣品真菌群落相似度較高，可能來自相同的起源。雖然根和根際土壤長期接觸，但從主坐標分析來看，根內生菌與根際土壤真菌的距離仍然較遠，表明兩者真菌菌群來源并不相同。

2.5 內生真菌及根際土壤真菌群落的FUNGuild功能類群預測

利用FUNGuild數據庫對黑老虎內生真菌及根際土壤真菌群落進行功能預測分析，結果發現未分類菌落（unassigned）在根際土、根、莖中占比較高，分別為31.5%、37.3%和35.8%；而病理寄生型（pathotroph）功能群在黑老虎組織和根際土壤中所占比例次序為葉（62.9%）>莖（37.5%）>根際土（16.7%）>根（9.2%），表明病理寄生型功能群在生長旺盛的組織中占比較高。根際土壤中，其他營養類型如腐生型（saprotroph，10.2%）、病理寄生-腐生-共生型（pathotroph-saprotroph-symbiotroph，12.7%）、腐生-共生型 （saprotroph-symbiotroph，13.9%）在根際土中占比超過10%；而根中超過10%的功能菌群有腐生-共生型（saprotroph-symbiotroph，17.8%）和病理寄生-腐生型（pathotroph-saprotroph，17.2%）， 莖和葉中超過10%的功能菌群分別為共生型（symbiotroph，13.7%）和病理寄生-共生型（pathotroph-symbiotroph，10.7%）（圖6：A）。

對各樣品中超過1%的菌群進行詳細的物種生態功能預測分類，除未分類菌落（unassigned）占一定比例外，黑老虎內生真菌和根際真菌已鑒定出的主要生態功能菌為植物病原菌（plant pathogen），在根際土、根、莖和葉中占比分別為15.4%、9.1%、37.5%和62.9%（圖6：B）。在超過10%的生態功能菌群中，根際土真菌為內生菌-枯枝腐生型-土壤腐生型-未定義腐生型（endophyte-litter saprotroph-soil saprotroph-undefined saprotroph，13.6%） ，根中為動物病原菌-真菌寄生蟲-未定義腐生型（animal pathogen-fungal parasite-undefined saprotroph，17.1%）和叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，17.0%）兩種，莖和葉中無其他類型的功能菌群占比超過10.0%。

3 討論與結論

在漫長的自然進化中，真菌與其宿主植物形成復雜的相互作用關系，真菌對植物的生長發育、抵御病原菌和外部非生物脅迫發揮了重要作用，同時部分內生真菌可以產生與宿主相同的次生代謝產物。由于傳統分離技術難以獲得不可培養的內生真菌，因此限制了內生真菌的進一步發掘。本研究利用高通量測序技術對黑老虎內生真菌和根際土壤真菌的群落組成和多樣性進行研究，發現了大量未分類的OTU：其一，表明與傳統分離培養方法相比，利用高通量測序技術可以發現更多的內生真菌；其二，表明黑老虎內生真菌和根際土壤真菌中存在大量未分類的真菌群落，可能受限于真菌數據庫限制，無法對這些真菌群落進行功能分類；其三，很多未被發掘的真菌群落可能難以進行人工分離培養，需要通過改良分離培養技術進一步發掘內生真菌。

Fuchs等（2017）研究表明，內生真菌的組成和結構受種屬、環境、組織等因素影響。從真菌群落結構組成結果來看，黑老虎根際土、根、莖和葉中真菌群落結構存在較大差異。在門水平上，黑老虎內生真菌及根際真菌的優勢群落均為子囊菌門和擔子菌門，但子囊菌門在葉和莖中占比超過90%，在已經發現的植物內生真菌中，優勢菌門多為子囊菌門，子囊菌門在不同組織中占比不同，可能與種屬特異性有關。在屬水平上，根際土壤真菌群落中被孢霉屬占比較高（13.5%），被孢霉屬為腐生真菌，在秸稈分解和土壤養分轉化中發揮重要作用（寧琪等，2022）。子囊菌門未分類屬和痂囊腔菌屬主要為植物致病菌，在葉片和莖稈等生長旺盛的組織中占比較高。通過聚類熱圖分析，黑老虎根樣品和根際土樣品的真菌群落結構更相似，而莖和葉樣品的真菌群落結構相近。土壤蘊含著豐富的微生物多樣性，根與土壤長期直接接觸，土壤真菌與根內生真菌相互影響，可能是造成真菌群落結構更為相近的原因（Ren et al.， 2019）。葉片和莖稈與土壤接觸較少且發育來源更為相似，可能是兩者內生真菌結構更為類似的原因。

對黑老虎內生真菌和根際土壤真菌群落進行多樣性分析，發現內生真菌和根際土壤真菌群落存在豐富的多樣性，其中根際真菌群落的豐度和多樣性顯著高于各組織的內生真菌，研究結果與很多藥用植物的根際真菌和組織內生真菌類似。王艷等（2019）研究發現，重樓根際及內生真菌多樣性的關系為根際土＞根莖＞根；周婕等（2019）研究發現，紫莖澤蘭根、莖、鮮葉、腐葉之間內生真菌群落組成差異明顯， 具有組織特異性，根際土壤與根內生真菌群落組成存在一定程度的相似。

黑老虎是傳統中藥材，根、莖等藥用部位富含木脂素類、三萜類、花色苷等藥用成分（舒永志等，2012），果實中富含酚酸、黃酮、氨基酸（Yang et al.， 2020）。從黑老虎中分離的內生真菌報道較少，而從五味子科藥材中分離到一些具有抗氧化、拮抗植物病原菌、轉化次級代謝物等功能的內生菌，從已報道的五味子科中分離的內生菌來看，主要有二形傘形屬 （Umbelopsis）和青霉屬（Penicillium）真菌等A. 營養型分類； B. Guild詳細分類。

（Wang et al.， 2017; 毛瑞華和竇智，2019；Qin et al.， 2019；Song et al.， 2021），這幾個真菌屬在本研究的組織中均有檢出，表明黑老虎與五味子同科植物中的內生真菌群落具有一定程度的相似性，可以借鑒五味子科內生真菌信息，發掘黑老虎中與次生代謝有關的內生真菌。

本研究FUNGuild功能預測結果顯示，葉中未知功能群占比相對較少，根際土、根和莖中未知真菌菌群較多，表明黑老虎根際土和根、莖組織中有大量未知的功能菌群，還有待進一步發掘。黑老虎根際土和組織中，病理寄生型（pathotroph）功能群較高，可能是因為黑老虎為常綠植物，葉和莖常年接觸外界空氣，此外莖和葉組織中營養物質含量較高，可能是造成病理寄生型真菌占比較高的原因，這與譙利軍等（2018）報道的莖和葉組織病理寄生型功能群較高一致。根際土壤中，腐生型（saprotroph，10.2%）、病理寄生-腐生-共生型（pathotroph-saprotroph-symbiotroph，12.7%）、腐生-共生型（saprotroph-symbiotroph，13.9%）這3種類型功能菌群超過10%，腐生型功能菌群占比較高可能是因為根際土壤中腐生真菌的種類繁多，根際土中存在腐生型功能菌群的機會更多（寧琪等，2021）。腐生真菌可以產生一系列水解酶和氧化酶，有助于碳水化合物的分解，與有機物分解和養分循環密切相關 （梁元存等，2003） 。根中超過10%的功能菌群有腐生-共生型（saprotroph-symbiotroph，17.8%）和病理寄生-腐生型（pathotroph-saprotroph，17.2%）兩種，可能是根與土壤長期密切接觸，腐生真菌進入根內成為內生真菌的機會更多（周婕等，2019）。莖和葉中的優勢功能類群分布不同，可能是植物內生真菌在不同組織中發揮了不同功能。隨著真菌功能的進一步發掘，黑老虎內生真菌和根際土真菌的功能將會進一步明確。

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（責任編輯 蔣巧媛 鄧斯麗）