黑頸鶴與灰鶴羽毛形態結構特征初步分析

王雯慧王 位季 佳李 玙苗 睿張玉平李曉穎宋天揚李素華何承忠

（1. 西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650233；2. 中國醫學科學院醫學生物學研究所，云南 昆明 650500）

黑頸鶴（Grus nigricollis）與灰鶴（Grus grus）均為鶴形目（Gruiformes），鶴科 （Gruide），鶴屬（Grus）的大型涉禽[1-2]。當前，黑頸鶴在全球范圍內僅有1 萬余只，被世界自然保護聯盟（IUCN）列為近危物種，是我國國家Ⅰ級重點保護野生動物[1]?；寅Q全球數量超70 萬只，被IUCN 列為無危物種，是我國國家Ⅱ級重點保護動物，也是我國鶴類中種群數量最大的種類[3]。

當羽毛微觀結構被作為鳥類物種識別鑒定的參考標準后，國內外研究者對于羽毛顯微結構做了大量研究[4]。國內對于鳥類羽毛顯微結構的研究自20 世紀90 年代后開始，如通過羽毛微觀結構對鶯亞科，雨燕科、佛法僧目等鳥類進行了分類鑒定[5-7]。近年來，鳥類羽毛宏觀結構指標的研究也見諸報道，如對猛禽覆羽形態特征量化的判別分析[8]。除了對鳥羽進行分類外，也有研究者認為對羽毛結構的量化分析可用于仿生學的研究[9]，但目前對鶴屬鳥類羽毛特征結構的研究甚少[10-11] 。

近年來，野生鳥類的盜獵案件時有發生，鶴屬鳥類也是盜獵者的捕殺對象。在野鳥的偷獵類刑事案件中，現場難以尋到完整的鳥類尸體，可供追查的線索中常見殘留的羽毛[12]。

本研究擬對鶴屬鳥類黑頸鶴和灰鶴的飛羽，次級飛羽，尾羽及絨羽的宏觀形態及微觀結構特征進行研究，對特征指標進行量化分析，尋求鶴屬鳥類羽毛結構的差異，以期積累鶴屬鳥類生理學基礎數據；同時使用羽毛樣本的特征指標的量化數據建立Fisher 判別式，為今后僅存羽毛的前提下鶴屬鳥類分類鑒定提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

選取黑頸鶴與灰鶴成鳥標本各3 只（其中黑頸鶴雌性1 只，雄性2 只；灰鶴雌性2 只，雄性1 只），皆由西南林業大學標本館收集自云南省內黑頸鶴自然保護區。取每具鶴類標本初級飛羽（第2～4 枚），次級飛羽（第1～3 枚），尾羽（自外側向內側第2、4、6 枚），另隨機取胸、腹、尾、腰、背、翼部形態完整的絨羽各10 枚。

1.1.2 主要試劑和儀器

所用的乙醇（95%，AR）、無水乙醇（AR）均購自四川西隴化工有限公司；數字病理切片掃描儀（KF-PRO 機型），購自寧波江豐生物信息技術有限公司；數碼相機（EOS700D），購自佳能公司；體式顯微鏡（SZX10 型），購自奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 羽毛外觀形態觀察及幾何形態分析

取初級飛羽、次級飛羽和尾羽，將完整羽毛樣本用少許自來水浸泡清洗后，展平，自然陰干，置于純色背景卡紙，放置比例尺，使用佳能數碼相機垂直近距離拍攝，觀察羽毛的顏色、形態、色斑等宏觀外形特征，并使用ImageJ 軟件對圖片進行處理，設置好比例尺并在Result 中勾選好需要獲得的參數。使用Threshold，ROI Manger功能測算羽片面積，羽片羽軸長，獲得每組羽毛每個指標各9 個數值，另計算羽片中段的內翈羽枝長，內翈羽枝與羽干的夾角，每組羽毛每個指標各取30 個值[12]。

1.2.2 羽小枝顯微結構觀察及分析

取各羽毛中段羽片，置于95% 乙醇中清洗1 h 后，無水乙醇中脫水1～2 min，自然陰干。在體視顯微鏡下，用眼科剪剪取羽片的一根羽枝，置于防脫載玻片上展平，用刻刀分離羽枝中段兩側的羽小枝，封片固定。絨羽的處理方法為取完整的羽枝，展平于防脫載玻片上，封片固定[13]。通過數字病理切片掃描儀掃描羽小枝切片，隨機取10 個視野，統計視野內有鉤羽小枝腹齒數，羽小鉤數，纖毛對數，無鉤羽小枝的腹齒數，每個指標各取30 組數據，利用K-Viewer 軟件測算視野內所有羽小節間距及節直徑[14-15]。

1.2.3 數據的統計分析

計算各特征的平均值，特征分析數據以“平均值 ± 標準誤”表示，若只涉及同一指標在2 個組別中的差異的比較選用獨立樣本t檢驗，2 個組別以上的差異比較使用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

形態結構具有顯著性差異的指標通過Fisher 判別分析，建立判別函數。使用Python 的numpy工具包進行有放回的隨機抽樣，每個指標抽樣100 次，在SPSS 中建立Fisher 判別函數，統計各函數的方差貢獻率及累計貢獻率，通過Wilks 的Lambda 的檢驗對判別函數進行顯著性檢驗，P＜0.05 表示判別能力顯著。利用回代估計法驗證判別函數的準確性。

2 結果與分析

2.1 羽毛宏觀形態結構特征

如圖1 所示，2 種鶴類的飛羽，次級飛羽，尾羽均無任何斑紋分布且以漸變純色為主?；寅Q（圖1a）與黑頸鶴（圖1d）初級飛羽的大部分面積均為純黑堅實的長羽片，靠近羽干基部有少量白色羽枝?；寅Q（圖1b）和黑頸鶴（圖1e）的次級飛羽顏色均呈現出從梢部至基部由深色漸變為淺色的特征，其中灰鶴次級飛羽的梢部深色部分為灰色，黑頸鶴次級飛羽的深色部分為棕黑色，黑頸鶴（圖1f）的尾羽梢部顏色為黑色，松散部分呈灰色；灰鶴（圖1c）的尾羽羽片梢部呈灰褐色，靠近羽根的部分呈灰白色松散狀，灰鶴次級飛羽、尾羽比黑頸鶴次級飛羽、尾羽顏色更淺，且較黑頸鶴存在更多的松散羽枝。

圖 1 黑頸鶴和灰鶴的羽毛形態結構特征Fig. 1 The morphological characteristic of feather from G. nigricollisand G. grus

2.2 羽毛宏觀形態特征分析

對灰鶴和黑頸鶴的羽毛宏觀形態進行分析，結果如表1 所示。黑頸鶴與灰鶴的內翈羽枝長均呈次級飛羽、尾羽、初級飛羽依次減小的特征（P＜0.05），而羽片面積以及羽片羽軸長均呈飛羽大于尾羽的特征（P＜0.05），內翈羽枝與羽干夾角皆為初級飛羽最小的特征（P＜0.05）。2 種鶴類的飛羽內翈羽枝長，尾羽內翈羽枝與羽干的夾角，初級飛羽羽片面積的數據存在明顯的差異（P＜0.05）。

表 1 黑頸鶴和灰鶴羽毛結構的宏觀指標分析Table 1 The statistics on macro index of the feathers fromG. nigricollisand G. grus

2.3 羽小枝的微觀結構特征

黑頸鶴和灰鶴初級飛羽、次級飛羽和尾羽微觀結構如圖2、圖3 所示，2 種鶴類正羽主要由有鉤羽小枝和無鉤羽小枝構成，且兩種羽小枝的微觀結構在種間具有相似性。黑頸鶴和灰鶴的有鉤羽小枝基部結構為基柄，著生有腹齒，梢部結構為羽脈，著生纖毛和羽小鉤；二者次級飛羽的有鉤羽小枝可見背纖毛結構短粗，腹纖毛細長，羽脈梢部纖毛結構逐漸退化（見圖2b、e）；尾羽有鉤羽小枝較飛羽的有鉤羽小枝更纖長（見圖2c、f）。無鉤羽小枝的羽脈無纖毛和羽小鉤，基柄皆有平行排列的深色色素條紋，基柄末端為鋸齒狀腹齒（見圖3）。

2 種鶴類的絨羽微觀結構如圖4 所示，由節狀羽小枝構成，羽小枝竹節狀，節間著生纖毛結構。節狀羽小枝梢部部纖毛退化，節直徑變小，節逐漸不明顯，節尖不露出（見圖4c、f）；著生纖毛多見不對稱纖毛結構（見圖4a、d），也可見單側纖毛（見圖4b、e）。

圖 2 黑頸鶴和灰鶴有鉤羽小枝顯微結構特征Fig. 2 The microstructure characteristic of distal barbules from G. nigricollisand G. grus

圖 3 黑頸鶴和灰鶴無鉤羽小枝顯微結構特征Fig. 3 The microstructure characteristic of proximal barbules from G. nigricollisandG. grus

圖 4 黑頸鶴和灰鶴節狀羽小枝顯微結構特征Fig. 4 The microstructure characteristic of nodular barbules from G. nigricollisand G. grus

2.4 羽小枝微觀結構特征分析

黑頸鶴和灰鶴類的羽毛微觀結構特征分析結果見表2。黑頸鶴有鉤羽小枝腹齒數為2～4 枚、纖毛對數4～8 對、羽小鉤數為5～8 枚，無鉤羽小枝腹齒數4～7 枚?；寅Q有鉤羽小枝的腹齒數為2～4 枚、纖毛對數4～8 對、羽小鉤數5～9 枚，無鉤羽小枝腹齒數4～6 枚。且2 種鶴的有鉤羽小枝纖毛對數均呈現呈初級飛羽、次級飛羽、尾羽依次增大的規律（P＜0.05）。

表 2 黑頸鶴和灰鶴羽毛顯微結構指標分析Table 2 The statistics on the indexes of microstructure of feathers from G. nigricollisand G. grus

2 種鶴類次級飛羽的有鉤羽小枝的腹齒數、纖毛對數、羽小鉤數，無鉤羽小枝腹齒數均存在顯著差異（P＜0.05）；初級飛羽的無鉤羽小枝腹齒數、尾羽的有鉤羽小枝羽小鉤數也均存在明顯差異（P＜0.05）。

黑頸鶴絨羽節狀羽小枝羽小節間距小于灰鶴，羽小節直徑大于灰鶴（P＜0.05）。

2.5 羽毛的特征指標的Fisher 判別分析

以2 種鶴羽毛的形態特征指標為變量，對2 種鶴的歸屬進行判別分析，一共獲得Y1、Y2、Y3、Y4、Y55 個典型判別函數，見表3。在Fisher 判別分析中，判別方程的準確率可用其方差所占的比例來判別。由表4 可知，其Y1、Y2累積方差貢獻率為97.7%，可以解釋絕大部分樣本信息。由此得出以下典型判別函數：

式中：X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8分別代表了有鉤羽小枝羽小鉤數、有鉤羽小枝成對纖毛數、有鉤羽小枝腹齒數、無鉤羽小枝腹齒數、內翈羽枝與羽干夾角、內翈羽枝長、羽片面積和羽片羽軸長這8 個特征指標。

在Wilks 的Lambda 檢驗中得出2 個函數的顯著性水平均小于0.05，即函數Y1、Y2在以羽毛的特征指標為變量，對灰鶴與黑頸鶴的種屬判別能力顯著（P＜0.05）。利用回代估計法對構建判別函數的數據逐一進行檢驗，所得的判別方程的正確率為80.2%。

表 3 典型判別函數系數項和常數項Table 3 Coefficient term and constant term of typical discriminant function

3 結論與討論

本研究對灰鶴與黑頸鶴的初級飛羽、次級飛羽、尾羽和絨羽的羽片外觀形態結構與羽小枝的顯微結構進行觀察，對羽片和羽小枝的形態指標進行了測算和統計分析，積累了鶴屬鳥類羽毛微觀結構的數據資料；同時以形態特征指標為變量構建了2 個典型的Fisher 函數，研究發現有鉤羽小枝羽小鉤數、成對纖毛數、腹齒數，無鉤羽小枝腹齒數，內翈羽枝與羽干夾角，內翈羽枝長，羽片面積和羽片羽軸長這8 個特征指標均可作為二者鑒別的依據。

野生的鶴屬鳥類在形態上很容易識別，本研究中建立的應用羽毛的形態結構特征進行黑頸鶴與灰鶴的物種鑒定方法，主要應用于僅可獲取羽毛樣本的條件下開展2 種鶴的物種鑒定。在涉及野生鳥類盜獵事件中，羽毛是物種鑒定進行案件偵破的重要線索，目前可見研究者集中于隼形目、鸮形目等鳥類正羽及絨羽的羽小枝的微觀結構研究[12,14,16-21]，本研究中所建立的基于羽毛形態結構的物種鑒定方法，將來可應用于海關、森林公安查獲案件后送檢羽毛樣本的物種鑒定。

與已報道量化指標相比[11]，本研究中黑頸鶴初級飛羽的有鉤羽小枝呈現出羽小鉤數量更多，成對纖毛數更少的特征，這種差異的原因可能為有鉤羽小枝的羽小鉤數和纖毛數在種內具有可變性，纖毛可發育成為羽小鉤。費榮梅等[22]提出，羽小鉤數目和纖毛數目之和可能是一個恒定值，提示在羽毛微觀形態結構研究中應進一步確認有鉤羽小枝的羽小鉤數目和纖毛數目之和，探討其是否可作為鳥類分類的依據。

本研究建立的基于羽毛形態特征的物種鑒別方式，在具有完善的數據庫的前提下，具有鑒別耗時短、對設備要求不高的優勢，但不足之處在于本研究選用的樣本數量和樣本種類較少，僅取樣了成年個體的羽毛樣本，幼鳥的羽毛發育不完整，形態結構特征也不穩定，因此結合分子、化學方式開展幼鳥羽毛的鑒別具有重要意義[23]。鶴類為遷徙動物，云南為黑頸鶴與灰鶴的越冬地[24-25]，本研究中只針對在越冬地的個體，可能會對區分黑頸鶴與灰鶴的羽毛特征產生一定影響。進一步探索年齡、性別、季節、環境對鶴屬鳥類的羽毛宏觀、微觀結構所造成的影響，可為鶴屬鳥類的保護與鑒定提供更翔實的基礎數據。