檸檬酸水解法制備大豆多肽的研究

楊培周，陸書花，李叢旭，王澤民

（1. 合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230601；2. 安徽紅花食品有限公司，安徽蚌埠 233799）

大豆多肽是大豆蛋白水解后得到的分子質量在6 000 Da 以下，長度為2~20 個氨基酸的小分子蛋白片段或氨基酸鏈，具有一定的生物活性，有利于人體的消化吸收[1]。目前，已被國內外研究證實的保健功效包括降血壓、降血糖、降膽固醇、抗腫瘤、免疫調節等[2]。雖然大豆多肽的生產已經擁有很長一段歷史，但是傳統工業化生產方法仍然存在著較多急需解決的難題。

大豆種子含有多種內源酶，其中蛋白酶（包括內肽酶和外肽酶） 是最重要的部分。蛋白酶可以將蛋白質水解成多肽、寡肽和游離氨基酸，從而改變蛋白質的功能、營養和感官特性[3]。Chen Y M 等人[4]在大豆水提取物中鑒定出16 種內肽酶、13 種外肽酶、24 種蛋白酶抑制劑和1 種谷氨酸脫羧酶，其中天冬氨酸內肽酶在pH 值為2.5~3.0，溫度為35~45 ℃時活性最佳。大豆中的內源性蛋白酶可在酸性、中性和堿性條件下發揮水解作用[5]。檸檬酸作為人體內三羧酸循環中的主要中間代謝物，對人體健康無害，是一種安全的食品添加劑，現已廣泛應用于食品、醫藥等行業[6]。尹彥洋等人[7]將檸檬酸與胃蛋白酶協同水解牛骨粉制備多肽，當檸檬酸作用于蛋白質時，蛋白質因其次級鍵受到破壞而分解，在胃蛋白酶協同作用下可獲得大量低分子肽。

以大豆為研究對象，采用檸檬酸酸解大豆蛋白方法，通過調節pH 值，控制孵育溫度和時間，制備大豆多肽。除添加少量檸檬酸外，不含其他任何添加劑和酶制劑，有效降低了風險，實現生產全過程的綠色高效和低能耗，降低了生產成本。所制備的大豆多肽可應用于食品等領域，具有良好的應用價值。

1 材料與方法

1.1 試劑耗材和儀器設備

黃豆，產自北京市密云區；牛血清蛋白；TEMED；三氯乙酸；十二烷基硫酸鈉；考馬斯亮藍G-250；溴酚藍；低分子量蛋白質Marker（14.4~97.4 kDa）和4×蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑），北京索萊寶科技有限公司提供；氫氧化鈉、檸檬酸、甲醇等為分析純，均購自國藥集團。

L18-P132 型高速破壁調理機，九陽股份有限公司產品；凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司產品；UV-1201 型紫外分光光度計，北京瑞利公司產品；EPS-300 DNA 型電泳設備、PHS-25 型pH 計，上海天能科技和大普儀器有限公司產品；HH-4 型水浴鍋，國華電器公司產品；5430R 型低溫高速離心機，德國Eppendorf 公司產品。

1.2 大豆多肽質量濃度和蛋白質質量濃度的測定

大豆多肽質量濃度測定的方法依據在波長238 nm處，蛋白質溶液吸光度的大小與肽鍵的數量呈正比[8]。配制質量濃度為10 mg/mL 的牛血清蛋白標準溶液，分別稀釋成質量濃度為50~300 μg/mL 的標準溶液，以蒸餾水作為空白對照，在波長238 nm 處測定不同質量濃度的吸光度，繪制標準曲線，所得多肽標準擬合方程為Y=0.001 44X-0.054 8，R2=0.997。

蛋白質標準曲線的制作參照文獻[9]考馬斯亮藍法。吸取0.1 mL 0~100 μg/mL 的標準蛋白質溶液于5.0 mL 考馬斯亮藍溶液中，充分混勻后，避光靜置10 min 后于波長595 nm 處測定其吸光度。得到的蛋白質標準擬合方程為Y=0.006 2X+0.111 2，R2=0.998。

樣品中多肽質量濃度的測定方法：取均質樣品2 mL 于試管中添加質量分數為10%（W/V） 的三氯乙酸溶液2 mL，充分混勻后靜置15 min 以沉淀蛋白，以轉速3 500 r/min 離心10 min，取上清液，以去離子水為空白對照，在波長238 nm 處測定樣品的吸光度，確定樣品中的多肽含量。

樣品中蛋白質含量的測定方法：在10 mL 試管中加入0.1 mL 樣品離心后的上層清液，再加入5 mL考馬斯亮藍溶液，充分混勻后，避光靜置10 min。于波長595 nm 處測定樣品吸光度，確定樣品中蛋白質含量。

1.3 檸檬酸浸泡對大豆蛋白水解情況的影響

為了探究打漿前檸檬酸浸泡大豆對豆漿中蛋白質含量的影響[10]，每組稱取大豆各50 g，用去離子水浸泡清洗2 次，瀝干水分后以豆液質量比為1∶5，使用質量分數為0~15%（W/W） 的檸檬酸溶液于常溫條件下浸泡15 h。浸泡后，使用去離子水清洗3 次后以豆液質量比1∶9 打漿3 min，使用100 目尼龍濾布進行過濾，去除濾渣，得到生豆漿。以轉速13 000 r/min 離心5 min，取上層清液，用于蛋白質含量測定和SDS-PAGE 表征蛋白水解的情況[11]。

1.4 孵育pH 值對大豆多肽含量的影響

稱取大豆50 g，清洗3~4 次后，用去離子水以豆液質量比1∶5 于常溫條件下過夜浸泡。按步驟1.3 生豆漿制備的方法進行打漿、過濾。將生豆漿均勻分成7 等份（每份50 mL），利用質量分數為5%（W/W） 的檸檬酸溶液或濃度為1 mol/L 的氫氧化鈉溶液將各組生豆漿pH 值分別調至3，4，5，6，7，8，9 后，置于50 ℃水浴鍋中孵育5 h。孵育結束后，以轉速13 000 r/min 離心5 min，取上層清液，測定多肽含量及SDS-PAGE分析蛋白水解情況。

1.5 孵育溫度對大豆多肽質量濃度的影響

制備450 mL 生豆漿，使質量分數為5%（W/W）的檸檬酸溶液將pH 值調至4，均勻分成7 等份，將每組樣品分別置于30，35，40，45，50，55，60 ℃的恒溫水浴鍋中孵育5 h。孵育結束后，以轉速13 000 r/min 離心5 min，取上層清液，測定多肽質量濃度及SDS-PAGE 分析蛋白水解情況。

1.6 孵育時間對大豆多肽質量濃度的影響

制備300 mL 生豆漿，使用質量分數為5%（W/W）檸檬酸溶液將pH 值調至4，均勻分成6 等份，置于50 ℃水浴鍋中分別孵育3，4，5，6，7，8 h，孵育結束后，以轉速13 000 r/min 離心5 min，取上層清液，測定多肽質量濃度及SDS-PAGE 分析蛋白水解情況。

1.7 響應面優化試驗

根據單因素試驗的結果，選擇孵育pH 值、孵育溫度、孵育時間3 個指標進行響應面優化分析（三因素三水平），并通過軟件模擬獲得二次多項式回歸方程，得出制備大豆多肽最佳的工藝參數，以大豆多肽含量為響應值。

響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計

1.8 SDS-PAGE 凝膠電泳

取離心后的樣品上清液30 μL 于試管中，加入10 μL 4×蛋白上樣緩沖液。于100 ℃沸水中加熱5 min，使蛋白變性。以轉速13 000 r/min離心3 min，取上清液進行電泳。使用考馬斯亮藍染色液G-250染色，過夜脫色后拍照。

1.9 統計分析

試驗數據均采用SPSS 8.0 軟件進行統計分析，Origin 9.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 檸檬酸浸泡對蛋白質質量濃度的影響

不同質量分數檸檬酸浸泡大豆對豆漿中蛋白質質量濃度的影響見圖1。

圖1 不同質量分數檸檬酸浸泡對豆漿中蛋白質質量濃度的影響

由圖1 可知，豆漿中蛋白質質量濃度隨檸檬酸質量分數的變大先降低后增加，在檸檬酸質量分數為5%時，蛋白質質量濃度達到最低為49 μg/mL。當溶液中檸檬酸質量分數偏高時，可能破壞了大豆內源性蛋白酶的活性或未處于其最適pH 值，無法大量水解大豆蛋白。

2.2 單因素試驗結果

孵育pH 值對豆漿中多肽質量濃度的影響見圖2。

圖2 孵育pH 值對豆漿中多肽質量濃度的影響

由圖2 可知，隨著孵育pH 值的增大，多肽質量濃度先增加后降低。孵育pH 值為4 時，豆漿體系中多肽的質量濃度達到最大值為1 429 μg/mL。此外，在孵育pH 值為6 和7 時，多肽質量濃度無明顯變化，這可能由于生豆漿的孵育pH 值一般在6~7，大分子蛋白未發生水解；當孵育pH 值為8 和9 時，溶液為堿性，此時多肽質量濃度分別為920 μg/mL 和915 μg/mL。多肽含量的降低可能是由于堿性條件下，產生的多肽被大豆內源性肽酶分解為氨基酸。

孵育溫度對豆漿中多肽質量濃度的影響見圖3。

圖3 孵育溫度對豆漿中多肽質量濃度的影響

由圖3 可知，多肽質量濃度隨著溫度的升高先增加后降低。50 ℃處理組中多肽質量濃度最高為1 391 μg/mL；在30~50 ℃處理組，隨著溫度的升高，大豆內源性酶活性逐步提高，產生的多肽質量濃度變多。當溫度大于50 ℃時，樣品中多肽質量濃度逐漸下降，主要原因是大豆蛋白和部分小分子多肽在內源蛋白酶和內外肽酶的作用下進一步水解產生游離氨基酸[11]。

孵育時間對多肽質量濃度的影響見圖4。

圖4 孵育時間對多肽質量濃度的影響

由圖4 可知，隨著孵育時間的延長，多肽質量濃度快速增長，在孵育時間為6 h 時，達到最大值為1 261 μg/mL；孵育7 h 和8 h 后，多肽質量濃度分別為1 259.62 μg/mL和1 260.34 μg/mL，與孵育6 h多肽質量濃度基本保持一致，因此豆漿的最適孵育時間為6 h。

2.3 響應面試驗優化結果

基于單因素試驗結果，進行響應面優化試驗。

響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果

由表2 可知，運用Design Expert 10 軟件對各因素進行回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

響應面方差分析見表3。

表3 響應面方差分析

方差分析是評價回歸模型的有效方式之一。由表3 可看出，得到的模型p 值為0.000 1（<0.001 0），說明該模型差異極顯著，失擬項為0.421 4>0.050 0不顯著，表明外界非試驗因素對試驗結果沒有顯著影響。相關系數R2=0.998 9，R2Adj=0.997 5，說明模型擬合程度較好，預測得率與實際多肽得率之間有較高的擬合度，試驗誤差較小，方法可行。根據F 值大小可判斷，3 個因素對多肽質量濃度的影響程度依次為孵育溫度>孵育pH 值>孵育時間。

孵育pH 值和孵育溫度對多肽質量濃度影響的響應面和等高線圖見圖5，孵育pH 值和孵育時間對多肽質量濃度影響的響應面和等高線圖見圖6，孵育溫度和孵育時間對多肽質量濃度影響的響應面和等高線圖見圖7。

圖5 孵育pH 值和孵育溫度對多肽質量濃度影響的響應面和等高線圖

圖6 孵育pH 值和孵育時間對多肽質量濃度影響的響應面和等高線圖

圖7 孵育溫度和孵育時間對多肽質量濃度影響的響應面和等高線圖

圖5 的鞍面最陡，說明孵育pH 值和孵育溫度的交互作用對多肽質量濃度的影響最大。圖6 呈現有一定坡度的斜面，說明孵育pH 值和孵育時間之間存在一定的相互作用。而圖7 中的鞍面較為平緩，說明孵育溫度和孵育時間之間的交互作用不顯著。

通過響應面優化分析得出最佳的多肽制備條件為孵育pH 值4.18，孵育溫度48.45 ℃，孵育時間6.21 h?？紤]到實際操作情況將制備工藝調整如下：孵育pH 值4.0，孵育溫度48 ℃，孵育時間6 h，調整后制備的多肽質量濃度為1 437 μg/mL，與理論值接近。說明上述擬合模型具有可靠性。

2.4 SDS-PAGE 凝膠圖譜分析

2.4.1 不同質量分數檸檬酸浸泡對大豆蛋白水解的影響

利用SDS-PAGE 電泳，分析不同濃度檸檬酸浸泡大豆對豆漿體系中蛋白質水解的影響。

不同質量分數檸檬酸浸泡后大豆蛋白的SDSPAGE 圖譜分析見圖8。

圖8 不同質量分數檸檬酸浸泡后大豆蛋白的SDS-PAGE 圖譜分析

由圖8 可知，未添加檸檬酸處理的樣品組含有較復雜的蛋白條帶，質量分數最高的蛋白分子量主要集中在66，43，31，22 kDa 附近。當檸檬酸浸泡質量分數為2.5%時，分子量為97 kDa和60 kDa 左右的大分子蛋白水解效果較差，但其他大于22 kDa 的蛋白均被水解。當質量分數為5.0%時，豆漿體系中蛋白質幾乎完全被分解，與2.5%相比，97.4 kDa 附近的條帶消失，僅在50 kDa 和小于22.0 kDa 處有較淺的蛋白條帶。當檸檬酸質量分數達到7.5%時，43~90 kDa 的范圍中，出現與空白組對應的蛋白條帶，說明檸檬酸質量分數過高導致的大豆內源性蛋白酶失活無法水解大豆蛋白。因此選擇5%的檸檬酸浸泡大豆使后續豆漿體系中大分子蛋白充分水解為多肽和氨基酸。

2.4.2 不同孵育pH 值對大豆蛋白水解的影響

利用SDS-PAGE 電泳，分析不同孵育pH 值條件下的大豆蛋白樣品。

不同孵育pH 值條件下大豆蛋白的SDS-PAGE圖譜分析見圖9。

圖9 不同孵育pH 值條件下大豆蛋白的SDS-PAGE 圖譜分析

由圖9 可知，當豆漿溶液pH 值為6 和7 時，圖譜顯示蛋白均未發生水解，條帶位置和強度基本一致。當豆漿體系為堿性；pH 值為8 和9 時，超過66.2 kDa 的部分蛋白發生少量水解，含量降低，但仍有較多的大分子蛋白未被水解。此外，在31.0 kDa和21.0 kDa 附近出現新的蛋白條帶（紅色箭頭）。這說明，當溶液為堿性時，可在一定程度上使大豆蛋白水解為分子量較小的蛋白質；當豆漿體系為酸性即pH 值為3，4，5 時，從圖譜中可看出大分子蛋白均被水解。pH 值為4 和5 時，蛋白條帶基本一致（條帶2 和3），條帶2 蛋白含量較低顏色較淺；當pH 值為3 時，66.2 kDa 的大分子蛋白未被水解（橙色箭頭），其主要原因可能是過低的pH 值使大豆內源性蛋白酶失活，難以起到輔助檸檬酸酸解大豆蛋白的作用。因此，不同pH 值處理組中蛋白質質量濃度及種類均發生變化，說明大豆內源性蛋白酶最適pH 值不同導致不同水解大豆蛋白種類。

3 結論

研究了不同質量分數檸檬酸浸泡大豆對豆漿體系中蛋白質質量濃度的影響，采用單因素試驗和響應面設計試驗，對檸檬酸酸解大豆蛋白制備多肽的條件進行了優化。結果表明，5%檸檬酸浸泡大豆可使豆漿中蛋白質質量濃度降低至49 μg/mL，當孵育pH 值4.0，孵育溫度48 ℃，孵育時間6 h 時，制備的多肽質量濃度為1 437 μg/mL。通過SDS-PAGE 電泳發現大豆蛋白的分子量集中在43.0~97.4 kDa，不同孵育pH 值對豆漿中蛋白質的質量濃度和種類有較大的影響。經多肽質量濃度和圖譜分析表明經酸性條件處理后，大豆中大部分蛋白被水解為多肽。