食品中沙門氏菌測定能力驗證和關鍵控制點分析

宋 洋

（寧德市食品藥品檢驗檢測中心，福建寧德 352100）

0 引言

沙門氏菌（Salmonella） 是一種常見的、容易造成食源性疾病的細菌[1]。1885 年美國細菌學家D. E.Salmon 首次從豬腸道中分離出這種細菌而得名，目前發現的沙門氏菌屬有腸道沙門氏菌和邦戈爾沙門氏菌2 種，大約有2 600 種血清型[2-3]。人食用沙門氏菌污染的食物，可能導致食物中毒，大多數表現為患上腹瀉等胃腸道疾病[4]。

為了防止沙門氏菌污染的食品流入市場，保障食品安全，我國禁止在散裝即食食品和預包裝食品中檢出沙門氏菌[5-6]，并制定《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》 （GB 4789.4—2016）[7]。機構或企業對沙門氏菌的檢測需求也不斷加強，為了不斷保障和提高沙門氏菌的檢測能力，可以選擇參加能力驗證。能力驗證是指利用實驗室間比對，按照預先制定的準則評價參加者的能力，實驗室間比對是按照預先規定的條件，由2 個或多個實驗室對相同或類似的物品進行測量或檢測的組織、實施和評價[8]。參加能力驗證，能提高或確保檢測方法的有效性，符合國際質量標準的要求[9]。該實驗室希望通過參加“食品微生物（沙門氏菌） 的測定”能力驗證，并通過分析檢測過程，提升對沙門氏菌的檢測能力。

1 材料和方法

1.1 樣品

實驗室參加華測檢測認證集團股份有限公司開展的“CTI-0422110131 食品微生物（沙門氏菌） 的測定”能力驗證計劃后，收到該公司寄出的2 瓶真空西林瓶裝樣品。

1.2 培養基和試劑

緩沖蛋白胨水（BPW，批號：191023）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC，批號：201222）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB，批號：210223）、HE 瓊脂（HE，批號：210607）、亞硫酸鉍瓊脂培養基（BS，批號：210125）、沙門氏菌顯色培養基（批號：210603）、0.1%煌綠溶液（批號：211214）、碘液（批號：220104） 等，北京陸橋技術股份有限公司提供；沙門氏菌生化鑒定盒（批號：5110419），廣東環凱生物科技有限公司提供；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（XLD，批號：1090311），廣東環凱微生物科技有限公司提供；氯化鈉（NaCl，批號：20220514），國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.3 儀器設備

HFsafe-1200 型生物安全柜，上海力申科學儀器有限公司產品；MLS-3751L-PC 型高壓蒸汽滅菌器，日本三洋電子科技有限公司產品；GNP-9270 型隔水氏恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司產品；YP3002 型電子天平，余姚金諾天平儀器有限公司產品；HYCD-290 型醫用冷藏冷凍冰箱，青島海爾特種電器有限公司產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗前期準備

（1） 樣品信息登記。將收到的樣品進行完整度檢查并登記樣品信息，CTI-0422110131 食品微生物（沙門氏菌） 的測定能力驗證樣品2 瓶，瓶身標識分別為No.006 和No.107。將樣品置于-20 ℃保存，閱讀能力驗證計劃作業指導書后開始試驗。

（2） 培養基配制和滅菌。分別按照培養基和試劑瓶身標識說明，配制225 mL BPW 培養基2 份，100 mL TTB 培養基1 份，10 mL SC 培養基2 份，150 mL BS 培養基1 份，150 mL XLD 培養基1 份，150 mL HE 培養基1 份，150 mL 沙門氏菌顯色培養基。將上述培養基，按照121 ℃，15 min 條件進行蒸汽滅菌，在生物安全柜內將對應量碘液和0.1%煌綠溶液加入TTB 后進行分裝，每10 mL 裝入1 支試管。BS、XLD、HE、沙門氏菌顯色培養基按每個平皿約20 mL 進行倒平板。

（3） 無菌生理鹽水溶液。稱取1.35 g 氯化鈉（NaC）l 放入250 mL 錐形瓶中，加入150 mL 純化水，制成質量分數為0.9%的NaCl 溶液，按照121 ℃，15 min 條件進行蒸汽滅菌后制得。

（4） 無菌瓶。準備2 個250 mL 空的錐形瓶，按照121 ℃，15 min 條件進行蒸汽滅菌備用。

1.4.2 樣品處理

在生物安全柜內進行試驗。從冰箱取出的樣品No.006，回溫至室溫后，小心開啟西林瓶。按作業指導書要求，用60 mL 無菌生理鹽水對樣品進行再水化，先加4 mL，待樣品溶解后吸入無菌瓶中，用剩余56 mL 反復清洗西林瓶內壁，回收清洗液至無菌瓶，作為待測樣品原液，試驗編號6。另一個樣品No.107 按上述步驟同樣操作，試驗編號107。

1.4.3 預增菌和增菌

按照GB 4789.4—2016 方法開始檢驗，無菌操作取25 mL 6 號樣品原液倒入裝有225 mL BPW 的瓶中，搖勻后，放入36.0 ℃的恒溫培養箱培養14 h，輕搖后，移取1 mL 到TTB 內，于42.0 ℃的恒溫培養箱培養24 h，同時移取1 mL 到SC 內，于36.0 ℃的恒溫培養箱培養24 h。107 號樣品操作步驟相同。

1.4.4 分離

分別用接種環取SC 1 環，劃線接種于BS 平板、XLD 平板、HE 平板、沙門氏菌顯色平板各1 個，于36.0 ℃分別培養48 h（BS 平板） 或24 h（XLD 平板、HE 平板、沙門氏菌顯色平板），觀察菌落形態，與GB 4789.4—2016 中所述沙門氏菌屬菌落特征進行比較，鑒別是否有符合的典型菌落，對TTB 重復上述步驟，得到表1 和圖1。

圖1 增菌液中分離到的菌株在平板上的菌落形態直觀圖

表1 增菌液中分離到的菌株在平板上的菌落形態和鑒別

增菌液中分離到的菌株在平板上的菌落形態和鑒別見表1，增菌液中分離到的菌株在平板上的菌落形態直觀圖見圖1。

1.4.5 生化試驗

按照沙門氏菌生化鑒定盒使用說明書，挑取6號樣品經SC 增菌后分離到的菌株在BS 平板、XLD平板、沙門氏菌顯色平板上典型菌落各1 個，編為6-1，6-2，6-3。進行三糖鐵瓊脂和營養瓊脂培養，同時進行賴氨酸脫羧酶試驗，待試驗出結果后，根據說明書判斷可能的菌屬和種。從營養瓊脂平板上挑取可疑沙門氏菌屬菌落，按說明書要求進行沙門氏菌屬生化試驗：蛋白胨水（供靛基質試驗）、尿素瓊脂（PH7.2）、氰化鉀試驗，觀察現象。挑取107號樣品經SC 和TTB 增菌后分離到的菌株在XLD 平板、HE 平板上疑似沙門氏菌特征菌落的淡紅色中心且邊緣呈白色菌落、墨綠色菌落和黃褐色菌落各1 個，編號107-1，107-2，107-3。重復6 號樣品操作步驟。

1.5 結果上報和反饋

按能力驗證作業指導書要求，上傳試驗結果和相關記錄。根據能力驗證反饋結果進行分析。

2 結果和分析

6 號和107 號樣品經過增菌后在選擇性平板上的菌落，按照沙門氏菌生化鑒定盒說明書步驟開展生化試驗，說明107 號樣品未檢出沙門氏菌。挑取6 號樣品可疑沙門氏菌屬菌落進行沙門氏菌屬生化反應鑒別，說明6 號樣品中檢出沙門氏菌。

三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗結果和鑒別見表2，沙門氏菌屬生化反應鑒別見表3。

表2 三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗結果和鑒別

表3 沙門氏菌屬生化反應鑒別

按作業指導書要求填寫2 個樣品中沙門氏菌的定性結果：No.006 為陽性，No.107 為陰性，并上傳試驗原始記錄。華測檢測認證集團股份有限公司對能力驗證結果反饋為“滿意”，說明該實驗室順利通過此次能力驗證。

3 關鍵控制點分析

3.1 樣品接收和實驗前期準備

能力驗證組織方在寄出能力驗證樣品時會告知參與單位，參與單位在收到待測樣品后，要嚴格檢查待測樣品的完整度，確認無破損。如果收到待測樣品和寄出樣品時間間隔超過7 d、裝有待測樣品容器破損、待測樣品碎成粉末，建議和寄出樣品人員方溝通，重新寄出一份樣品，避免因為運輸原因導致待測樣品中微生物損耗或者染菌，降低通過率。收到樣品，詳細登記樣品信息后，若未立即開始試驗，應將樣品放入適宜貯存的環境中。準備開展或用于能力驗證的環境、儀器、培養基、試劑都應是經過檢定或檢測符合實驗需求的。試驗所用培養基和試劑應現配。試驗前要熟悉能力驗證作業指導書、GB 4789.4—2016 檢驗方法、生化鑒定試劑盒或生化鑒定儀器的說明書等內容。

3.2 試驗過程

BPW 用于預增菌，作用是修復受損傷的沙門氏菌，GB 4789.4—2016 中對BPW 培養時間規定為8~18 h，跨度較大，并且桂國弘等人[10]發現經過BPW 增菌12 h 處理后的冷鮮雞微生物，沙門氏菌的檢出率最高，所以試驗中對BPW 預增菌的時間要注意把握。GB 4789.4—2016 規定要同時用TTB 和SC進行增菌，是因為于沙門氏菌屬血清型較多，TTB和BS 增菌有互補效果，所以試驗中不能僅用其中1種進行增菌。GB 4789.4—2016 中要求選用的2 種選擇平板中至少1 種是BS 平板，可能是由于BS 平板選擇性較好。試驗過程中接種分離也比較重要，能力驗證中6 號樣品在部分選擇性平板中無菌落生長，可能是由于接種環蘸取的增菌液比較少或者增菌液未搖勻。生化試驗按GB 4789.4—2016 要求，可以選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統，試驗用的生化鑒定試劑盒，已經過驗收，符合試驗需求。由于本次能力驗證是定性試驗，所以也未進行沙門氏菌屬血清學鑒定、血清學分型試驗。有條件的實驗室可以利用如PCR 技術、LMAP 技術、生物傳感器技術、基因芯片、基因測序、MALDI 飛行時間質譜分析、快速檢測卡等檢測技術方法對樣品進行檢測，將結果與國標法檢測結果進行對比，確保能力驗證通過[11-13]。

3.3 結果處理

要按要求在規定時間內上報實驗結果，并上傳原始記錄。結果表示要符合要求，如本次試驗要求上報的定性結果用“陽性”或“陰性”表示，就不能用“+”“-”或“檢出”“未檢出”代替。

能力驗證出現結果錯誤的可能原因和處理方法見表4。

表4 能力驗證出現結果錯誤的可能原因和處理方法

4 結論

食品安全備受矚目，加強食品中致病菌的檢測重要性日益凸顯，提高檢測機構食品中致病菌檢測能力刻不容緩。實驗室參與沙門氏菌能力驗證作為機構檢驗檢測能力的一種方法[14]，是一種重要的外部質量保證手段，不僅考核實驗操作者的能力，也是對實驗室致病微生物檢測綜合能力的考核。通過參與能力驗證，可以發現試驗中包括實驗操作、儀器設備、數據和結果處理等存在的問題，以及與同行間的差異，對實驗室的相關技術水平有一個直觀的認識。但是，必須要注意的是單次能力驗證的結果只代表某一個時刻或某段時間實驗室對該項目的檢測能力，并不一定能完全體現實驗室的真實檢測能力[15]。定期開展沙門氏菌能力驗證并分析能力驗證中關鍵控制點，有助于提高實驗室人員的檢驗能力，提升機構的檢測水平，強化對食品安全的保障能力。