核桃過敏原成分PCR 方法的建立

吳玉雙，楊 倩，黃淑迪，陳 艷，姬 華

（1. 石河子大學食品學院，新疆石河子 832000；2. 國家食品安全風險評估中心中國醫學科學院創新單位（2019RU014 號），北京 100021）

在過去的20 年里，過敏反應和過敏反應的發生率在不同的國家都有所增加。在全世界范圍內，有高達6%的兒童和2%的成年人是過敏患者，并且這個數據呈現出明顯的上升趨勢[1-3]。近年來，食品過敏成為影響食品安全的重要影響因素之一[4-6]。過敏患者通常是無法治愈的，對過敏患者的唯一“治療”是從飲食中完全去除引發過敏的成分，因此過敏患者十分依賴加工食品的成分標簽。所以，為了盡可能地避免過敏患者因誤食而導致的過敏反應，我國與其他各國均采用將食品成分進行標示的方法[7]。核桃和其他堅果是最常引起嚴重過敏反應的食物，人們通常認為食用核桃是一種健康的飲食習慣，但是對核桃的過敏會導致嚴重危害甚至死亡。全球約有4.9%的人對核桃過敏[8]，15%的兒童是核桃過敏體質[9]。核桃過敏會引發機體產生一系列的過敏癥狀并對皮膚、呼吸道、消化道等造成傷害[10]，過敏反應不僅影響患者的身體健康，而且降低了他們的生活質量。然而，核桃在食品加工過程中被廣泛使用，患者想要完全避免誤食核桃過敏原是極其困難的，超過80%的受訪者認為應強調成分列表中的可能過敏原，并描述過敏原含量[11]。由此可見，與之相關的核桃過敏原的檢測方法是具有重大意義的，核桃過敏原的檢測主要有酶聯免疫吸附法（ELISA） 及聚合酶鏈反應（PCR） 2 種方法。Yano T 等人[12]利用傳統PCR 的方法檢測核桃過敏原，發現mat K 基因是是其基因組中特異性最強的基因。Linacero R 等人[13]在過敏原編碼序列上設計新型引物，利用熒光定量PCR 方法檢測食品中的核桃過敏原，檢測限為2.5 pg 核桃DNA，與ELISA 分析比較，該方法在核桃的痕量檢測中顯示出更高的靈敏度和可靠性。PCR 法在復雜食品中過敏原的定量分析及物種鑒定方面，具有其他方法無法比擬的優點，這使PCR 方法在動植物源性食物過敏原檢測方面，存在極大的優勢，適合國際法規所要求的食品中痕量過敏原的檢測原則[14]。

在所有核桃過敏原中研究最多的是英國核桃中的Juglans Jug r 1，一種2 S 白蛋白種子儲存蛋白，是引起過敏反應最主要的一種過敏原，可溶于水和低濃度鹽溶液[14]。Jug r 1 還是一種前體蛋白，可在生化反應中分裂為一個大亞基和一個小亞基S。通過對核桃DNA 的擴增，根據Jug r 1 設計出的3 對新型引物，旨在建立靈敏度高、特異性強的核桃PCR 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 食品材料

黃豆、青豆、蠶豆、綠豆、紅豆、巴旦木、榛子、夏威夷果、扁杏仁、開心果、葵花籽、碧根果、腰果、核桃、松子、鷹嘴豆、黑豆、花生，均購自石河子農貿市場。

1.1.2 設備

均質機；DNA 提取盒；分析天平，上海民橋精密科學儀器有限公司產品；數顯恒溫水浴鍋；漩渦振蕩器；凝膠成像系統，美國Bio-Rad 公司產品；小型臺式高速離心機；PCR 儀，Techne 公司產品；電泳儀，北京市六一儀器廠產品；微量核酸定量儀。

1.1.3 試劑

巰基乙醇、氯仿、500 bp ladder DNA marker，光明試劑廠提供；天根植物基因組DNA 提取試劑盒，天根公司提供；高鹽甘露醇瓊脂，青島高科技工業園海博生物技術有限公司提供；2×premix Taq，北京博大恒泰生物技術有限公司提供；瓊脂糖，北京索萊寶科技有限公司提供；50 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉鹽EDTA；100 mmol/L Tris-HCl。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

提取樣品DNA 需使用天根公司生產的天根植物DNA 提取盒，依據以下步驟依次操作：試驗最開始先將27 μL 無水乙醇與13 μL 緩沖液GD 混合，60 μL無水乙醇與15 μL 漂洗液PW 混合，將二者混合均勻。將混合好的緩沖液GP1 65 ℃水浴加熱，加熱完畢，再加入0.1%的巰基乙醇，后取700 μL 的混合溶液于離心管中，繼續水浴加熱。取核桃仁100 mg，在液氮的降溫下充分地碾磨，將研磨好的核桃粉末樣品馬上轉移到裝有緩沖液GP1 的離心管中，并迅速上下顛倒振蕩混勻后，再于65 ℃下水浴，時間為20 min，加熱過程中需要多次顛倒振蕩離心管，使之充分混勻?；靹蚝笤偌尤?00 μL 氯仿，充分混勻，離心（轉速12 000 r/min，時間10 min），將離心所得上清液收集到離心管中，再加入700 μL 緩沖液GP2，振蕩混勻?；靹蚝笠频绞占艿奈街鵆B3 中，離心（轉速12 000 r/min，時間30 s），離心結束后倒掉廢液。向吸附柱CB3 中加入500 μL 緩沖液GD，離心（轉速12 000 r/min，時間30 s），倒掉吸附管的液體，再將吸附柱CB3 放入無菌收集管中。向吸附柱CB3 中加入600 μL 漂洗液PW，離心（轉速12 000 r/min，時間30 s），倒掉吸附管的液體，將吸附柱CB3 重新放入無菌收集管中，重復以上步驟2 次。將吸附柱CB3 置于室溫下放置數分鐘，丟掉收集管，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3 放入無菌離心管中，向吸附膜的中間部位滴加100 μL 洗脫緩沖液TE，盡量使洗脫液全部滴在吸附膜上，室溫下放置5 min，離心（轉速12 000 r/min，時間2 min），離心后將上清液收集到離心管中。為提高DNA 的收集率，將收集到的液體重新移入到上述吸附柱CB3 中，吸附柱套入新的離心管中，離心（轉速12 000 r/min，時間2 min），離心后將上清液收集到離心管中[15]。用同樣的方法提取紅豆、黃豆、蠶豆、青豆、榛子、花生、綠豆、巴旦木、夏威夷果、扁杏仁、開心果、葵花籽、鷹嘴豆、碧根果、腰果、松子、黑豆的DNA。由于紅豆、黃豆、綠豆、黑豆質地較硬，提取前用無菌水浸泡1 h，便于研磨。

1.2.2 引物的設計

陽性參考：根據不同物種具有各自特異的基因，從Genbank 數據庫下載核桃的Jug r 1 的基因，利用Primer Premier 6 軟件設計出3 組引物，設計并利用NCBI 網站初步監測引物的特異性。查找文獻，利用2 對引物WAL-F/R（GATCTATATTGTTGGAAAATGTAGC/GGTTAGAATCATTAGTGGAAATCAG）[16]，Jur Primer-F/R（TTCAACGTGACCATCTCCCC/ACACGAGGATGTGCTTGCTA）[17]做陽性參考。

引物的設計：設計出3 對引物，Jur 1 Primer-F/R（CTGGAAGATAACTGGTGACTA/ATTAGCAAGACGAGGCATT） 158 bp；Jur 2 Primer-F/R（GACAACCAGCGGCAGCATT/GCACCATCTCCTCCATTTCCTC）145 bp；Jur 3 Primer-F/R（GGGTGAGGAAATGGAGGAGAT/GGATGTGC TTGCTAGTTGCTA） 199 bp。

1.2.3 各引物PCR 擴增條件優化

以核桃DNA 為模板，以1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，以確定3 對引物的各自最佳退火溫度。

1.2.4 各引物PCR 反應體系優化

WAL：Taq DNA 聚合酶12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA 模板1 μL，添加滅菌蒸餾水10.5 μL；Jur Primer：Taq DNA 聚合酶22 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加滅菌蒸餾水74 μL；Jur 1 Primer：Taq DNA 聚合酶25 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加滅菌蒸餾水20 μL；Jur 2 Primer：Taq DNA 聚合酶23 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加滅菌蒸餾水20 μL；Jur 3 Primer：Taq DNA 聚合酶23 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加滅菌蒸餾水20 μL。

PCR 擴增的反應條件見表1[18]。

表1 PCR 擴增的反應條件

1.2.5 特異性試驗

用市面上常見的干果豆類：黃豆、青豆、蠶豆、綠豆、紅豆、巴旦木、榛子、夏威夷果、扁杏仁、開心果、葵花籽、碧根果、腰果、核桃、松子、鷹嘴豆、黑豆、花生檢測引物的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗

分別取10 g 的核桃、花生加入不同研缽，快速研磨成粉末狀。制出含有0.01%，0.10%核桃成分的花生粉樣品[15]。將稀釋后的樣品的DNA 進行PCR 擴增，并進行電泳。

2 結果與分析

2.1 樣品DNA 提取效率

為避免利用天根植物DNA 提取盒提取的DNA出現假陰性，需經過檢測以確定是否適合后續的PCR 檢測。

樣品DNA 的提取效率見表2。

表2 樣品DNA 的提取效率

2.2 各引物PCR 擴增條件的確定

WAL 引物的最佳退火溫度為64 ℃，Jur 引物的最佳退火溫度為54 ℃，引物Jur 1 Primer，Jur 2 Primer，Jur 3 Primer 的最佳退火溫度需要設置溫度梯度確定[19]。

Jur 1 Primer 引物PCR 退火溫度的確認見圖1，Jur 2 Primer 引物PCR 退火溫度的確認見圖2，Jur 3 Primer 引物PCR 退火溫度的確認見圖3。

圖1 Jur 1 Primer 引物PCR 退火溫度的確認

圖2 Jur 2 Primer 引物PCR 退火溫度的確認

圖3 Jur 3 Primer 引物PCR 退火溫度的確認

由圖1 ~圖3 可知，最佳退火溫度為：Jur 1 引物50.7 ℃，Jur 2 引物（64.0 ℃；Jur 3 引物64.0 ℃。

Jur 1 引物的Tm值為50 ℃，設置退火溫度50~60 ℃，8 個梯度分別為A：60.0 ℃，B：59.2 ℃，C：58.0 ℃，D：56.1 ℃，E：53.8 ℃，F：51.9 ℃，G：50.7 ℃，H：50.0 ℃，如圖1 所示。在圖1 中，Jur 1 引物在50.7 ℃時，擴增出158 bp 大小的片段，且條帶清晰沒有拖帶，故Jur 1 引物的最佳退火溫度為50.7 ℃。

Jur 2 和Jur 3 引物的Tm值均為55 ℃，故均設置退火溫度50~64 ℃，形成8 個梯度，分別為A：64.0 ℃，B：62.9 ℃，C：61.2 ℃，D：58.5 ℃，E：55.3 ℃，F：52.7 ℃，G：51.0 ℃，H：50.0 ℃，如圖2 和圖3 所示。在圖2 中，Jur 2 引物在64.0 ℃時，擴增出145 bp大小的片段，且條帶清晰沒有拖帶，故Jur 2 引物的最佳退火溫度為64.0 ℃。在圖3 中，Jur 3 引物在64.0 ℃時，擴增出199 bp 大小的條帶，且條帶清晰沒有拖帶，故Jur 3 引物的最佳退火溫度為64.0 ℃。

2.3 引物的特異性檢測

Jur 1 Primer 引物對常見富含蛋白質植物DNA 擴增的結果見圖4，Jur 2 Primer 引物對常見富含蛋白質植物DNA 擴增的結果見圖5，Jur 3 Primer 引物對常見富含蛋白質植物DNA 擴增的結果見圖6。

圖4 Jur 1 Primer 引物對常見富含蛋白質植物DNA 擴增的結果

圖5 Jur 2 Primer 引物對常見富含蛋白質植物DNA 擴增的結果

圖6 Jur 3 Primer 引物對常見富含蛋白質植物DNA 擴增的結果

由圖4 ~圖6 可知，3 對引物的特異性良好。在圖4 中，Jur 1 引物只擴增出158 bp 大小的核桃DNA片段；同樣的，在圖5 和圖6 中，Jur 2 引物和Jur 3引物也分別只擴增出145 bp 和199 bp 大小的核桃DNA 片段。結果表明，對引物是核桃基因組DNA 的特異性引物，且特異性良好。

2.4 PCR 靈敏度的檢測

Jur 1 Primer 引物靈敏度檢測結果見圖7，Jur 2 Primer 引物靈敏度檢測結果見圖8，Jur 3 Primer 引物靈敏度檢測結果見圖9。

圖7 Jur 1 Primer 引物靈敏度檢測結果

圖8 Jur 2 Primer 引物靈敏度檢測結果

圖9 Jur 3 Primer 引物靈敏度檢測結果

在圖7 中，Jur 1 引物只在100%核桃基因組、10%核桃+ 90%花生基因組以及0.1%核桃+ 99.9%花生基因組中擴增出158 bp 大小的DNA 片段，故Jur 1引物的核桃檢測最低限為0.1%；同樣的，在圖8 中，Jur 2 引物只在100%核桃基因組、10%核桃+ 90%花生基因組以及0.1%核桃+ 99.9%花生基因組中擴增出145 bp 大小的DNA 片段，故Jur 2 引物的核桃檢測最低限為0.1%；而在圖9 中，Jur 3 引物在0.01%核桃+ 99.99%花生基因組中擴增出199 bp 大小的DNA 片段，故Jur 3 引物的核桃檢測最低限為0.03%。3 對引物相比而言，Jur 3 的靈敏度更高，適合于精密檢測。

3 結論

核桃過敏原的檢測主要有ELISA、普通PCR 和熒光PCR 等3 種方法，但是與其他2 種方法相比，普通PCR 方法所用的儀器簡單、操作方便、成本低，能夠滿足一般實驗室的要求，除此之外還有結果準確、靈敏度高等優點。試驗采用普通PCR 法，將核桃DNA 濃度進行梯度稀釋，利用設計的3 對引物進行靈敏度試驗，結果表明該方法靈敏度高，3 對引物的最低檢測限可達0.01%（質量分數）；試驗選擇18 種常見的干果豆類，利用設計的3 對引物進行特異性試驗，結果表明設計的3 對引物特異性強；最后，試驗所設計的引物來源于核桃的特有過敏原基因Jur 1，可提高試驗的準確度，有效避免試驗的假陽性。以上數據均表明該試驗建立的PCR 方法適用于食品中核桃成分的分析。

PCR 檢測過程中，影響PCR 檢測效果的因素有很多，其中DNA 的提取效率也是影響PCR 擴增效果的重要因素之一。此外，核桃中含有蛋白質、單寧、多糖、酚類及色素等次生代謝物質會影響Taq DNA聚合酶的活性，進而影響PCR 擴增的效果。以前曾用的多種核酸提取方法提取核桃的DNA，如SDS法、高鹽低PH 法、CTAB 法和簡易CTAB 法等，然而還是不能有效除去干擾物質，導致影響試驗結果的準確性。為了保證試驗的準確性和可靠性，采用試劑盒法提取核桃額DNA，避免的上述缺陷。但是試驗所使用的PCR，又需要花費大量的時間，因此還需去探索更快速、靈敏、準確的方法，如熒光定量PCR、質譜法和表面等離子共振生物生物傳感器等[19-20]。