40 種中草藥及其聯合應用對凡納濱對蝦源副溶血弧菌的體外抑菌作用

高曉華，張明輝

（上海市水產研究所，上海市水產技術推廣站，上海 200433）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）隸屬于弧菌科（Vibrionaceae），弧菌屬（Vibrio），廣泛分布于海洋、河口以及水產養殖環境中，是水生動物主要條件致病菌之一［1］，能夠感染包括大黃魚（Pseudosciaena crocea）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、雜色鮑（Haliotis diversicolor）等［2-5］多種水產養殖動物，給水產養殖業帶來較大危害。目前，使用抗生素仍是防治水產養殖動物細菌性感染的有效方式，然而抗生素的長期使用可造成病原菌耐藥性增強、治療效果變差以及藥物殘留對水產品質量安全潛在危害已成世界共識［6-7］。

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又名南美白對蝦，因其味道鮮美、營養豐富、生長快等特點，已成為我國重要的水產養殖品種［8］。據中國漁業年鑒統計，2021年我國凡納濱對蝦養殖總產量達197.7萬t，占對蝦養殖總量的86.88 %，主要產自廣東、廣西、山東等地［9］。近年來，凡納濱對蝦養殖場頻頻發生由致病性副溶血弧菌引起的對蝦急性肝胰腺壞死病，造成凡納濱對蝦大規模的急性死亡，嚴重制約了對蝦養殖產業的健康發展［10-12］，因此，凡納濱對蝦源副溶血弧菌的控制應予重點關注。

中草藥富含生物堿、有機酸、苷類等多種活性物質，具有抗菌、抗病毒等作用，研究證實其對水產動物細菌性、真菌性等疾病具有良好的防治效果，且不易產生耐藥性、無殘留、價格低廉，還具有促進水生動物生長、提高免疫力等優點［13-15］。目前，有關學者已開展了中草藥對魚源副溶血弧菌的抑菌作用相關研究，發現了對大菱鲆（Scophthalmus maximus）、大黃魚（Pseudosciaena crocea）、草魚（Ctenopharyngodon idella）源副溶血弧菌具有良好抑菌作用的石榴皮（Punica granatum）、黃連（Rhizoma coptidis）、烏梅（Fructus mume）、白頭翁（Pulsatilla chinensis）、黃芩（Scutellaria baicalensis）、五倍子（Rhus chinensis）等中草藥［16-18］，但從現有文獻來看，有關中草藥及其聯合用藥對凡納濱對蝦源副溶血弧菌的抑菌效果研究卻鮮有報道。鑒此，本研究通過牛津杯打孔法分析了40種常見中草藥對凡納濱對蝦源副溶血弧菌的體外抑菌效果，用微量肉湯稀釋法測定具有抑菌作用的中草藥對副溶血弧菌的最小抑菌質量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌質量濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），并選擇抑菌效果較好的中草藥聯合應用，進一步評價復方中草藥的體外抑菌效果，以期為后續篩選抗凡納濱對蝦源副溶血弧菌中草藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

副溶血弧菌FHBX-1，為本實驗室于上海市某凡納濱對蝦養殖場分離、鑒定并保存［10］。40 種常見中草藥（表1），購自上海益豐大藥房；LB 營養肉湯（LB Broth Lennox）、LB 營養瓊脂（LB Nutrient Agar）、Muller-Hinton 肉湯（Muller-Hinton Broth，MHB）、Muller-Hinton 瓊脂（Muller-Hinton Agar，MHA）購自北京陸橋技術股份責任公司。96 孔板、牛津杯及其他試劑耗材購自上海生工有限公司；0.85%氯化鈉溶液，由本實驗室自制。

表1 試驗中草藥名錄Table 1 Tested Chinese herbal medicines in experiment

1.2 中草藥提取液的制備

參照馬秀慧等［19］的方法制備中草藥提取液。將各供試中草藥置于60 ℃干燥箱中烘至恒質量，各取30 g，加300 mL自來水，浸泡1 h以后煎煮，大火煮沸后轉小火煮 30 min，過濾第1道藥液；藥渣加300 mL自來水，小火煎煮60 min，過濾第2 道藥液；藥渣加300 mL自來水，大火煎煮30 min ，過濾第3道藥液，將3次藥液合并后濃縮至30 mL，使中草藥提取液終質量濃度為1 g/mL，121 ℃高壓滅菌15min后取出，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 副溶血弧菌菌懸液的制備

參照高曉華等［10］方法進行副溶血弧菌菌懸液的制備。即無菌條件下將 -80 ℃保存的副溶血弧菌FHBX-1劃線接種至LB營養瓊脂平板上，30 ℃培養18 h。挑取單個菌落接種于LB營養肉湯中，置30 ℃搖床（200 r/min）培養20 h后，高速離心收集菌體，并用0.85%氯化鈉溶液重懸，采用麥氏比濁法測定其濃度，并將菌液濃度稀釋至1.0×107CFU/mL，置于4 ℃冰箱備用。

1.4 中草藥抑菌圈測定

參照張恒橋等［20］的方法，即采用牛津杯法打孔法測定40 種中草藥提取液對副溶血弧菌FHBX-1的抑菌圈大小，在無菌培養皿中先倒入約10 mL 滅菌MHA 培養基，待凝固后均勻放置4 個滅菌牛津杯，再倒入約10～15 mL MHA培養基，待凝固后，每個平板上加入100 μL 備用菌懸液，用一次性無菌棉棒涂抹均勻，待菌液完全吸收后，用鑷子取出牛津杯。每個平板上其中3孔加入80 μL中草藥提取液，1孔加入滅菌水為陰性對照，每種藥液均設置3個重復，30 ℃正置培養24 h觀察結果，并用游標卡尺測量抑菌圈的直徑（d）。抑菌圈直徑判斷標準［21］，d≥20 mm 為極度敏感（++++），20 mm＞d≥15 mm為高度敏感（+++），15 mm＞d≥10 mm為中度敏感（++），d＜10 mm 為低度敏感（+），無抑菌圈為不敏感（－）。

1.5 中草藥最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度的測定

參照陶莎等［22］的方法，即采用96孔板微量肉湯稀釋法分別測定具有抑菌作用的中草藥對副溶血弧菌FHBX-1的最小抑菌質量濃度（MIC）。無菌條件下，取一次性無菌96孔酶標板（A～H行×12列），每孔加入100 μL滅菌MH肉湯，A～D行的第1列加入待測中草藥提取液100 μL，充分混勻后，逐級稀釋至第11列，并從第11列孔中取出100 μL 棄去，每孔液體終體積均為100 μL。1～11 列提取液質量終濃度分別為500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49 mg/mL；A～C 行的1～11 列每孔加入10 μL 稀釋的菌懸液為試驗組，第12 孔不加入菌液，為陰性對照，D行的1～11 列不加入菌液，作空白對照組觀察是否生長細菌，第12孔加入10 μL菌液，作為陽性對照，一板一藥，30 ℃正置培養24 h觀察結果，試驗組與空白對照組透明度相似的質量濃度即為最小抑菌質量濃度，對于顏色較深不易判斷的孔需進行平板涂布培養，根據平板上菌落生長情況來確定孔內菌體生長情況。

最小殺菌質量濃度（MBC）測定，即選擇每組所有高于最小抑菌質量濃度的試驗孔，分別取100 μL液體均勻涂布于LB營養瓊脂培養基上，30 ℃倒置培養24 h后觀察結果，少于5個單菌落試驗組的質量濃度即為待測中草藥提取液的最小殺菌質量濃度。

1.6 中草藥聯合對副溶血弧菌FHBX-1 的體外抑菌效果

根據40 種中草藥對副溶血弧菌FHBX-1 的體外抑菌結果，篩選出6 種綜合抑菌作用較強的中草藥，按照夏與晴等［18］的方法，將篩選的6種中草藥原液兩兩組合按照體積1：1 的比例進行配比，組合成15組復方中草藥，并參照1.4、1.5節的方法測定不同中草藥兩兩聯合對副溶血弧菌FHBX-1的抑菌圈直徑、最小抑菌質量濃度（MIC）和最小殺菌質量濃度（MBC）。復方中草藥聯合抑菌指數［23］（fraction inhibitory concentration index，FICI）=甲藥聯合時MIC/甲藥單獨時MIC+乙藥聯合時MIC/乙藥單獨時MIC。判定標準：FICI≤0.5 為協同作用；0.5＜FICI≤1.0 為相加作用；1.0＜FICI≤2.0 為無關作用；FICI＞2.0為拮抗作用。

1.7 數據處理與分析

所有試驗數據采用SPSS 19.0軟件進行處理分析，以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 40種中草藥對副溶血弧菌FHBX-1的體外抑菌效果

由表2 可知，副溶血弧菌FHBX-1 對34 種單方中草藥表現為敏感，其對黃連、烏梅、黃柏、蘇木、五倍子、地榆、熟地黃等9種單方中草藥為極度敏感，抑菌圈直徑均大于20.00 mm，其中對黃連最敏感，抑菌直徑達25.41 mm；對石榴皮、香薷、黃芩等4 種中草藥高度敏感，抑菌圈直徑為15.00～20.00 mm；對大黃、女貞子、茵陳等18種中草藥中度敏感，抑菌圈直徑為10.00～15.00 mm；對香附、石菖蒲、杜仲3 種中草藥低度敏感，抑菌圈直徑均小于10.00 mm；對合歡皮、廣藿香、黃芪等6種中草藥不敏感。

表2 40種中草藥對副溶血弧菌FHBX-1的體外抑菌效果Table 2 The bacteriostatic effect of 40 kinds of Chinese herbal medicines on V.parahaemolyticus FHBX-1 in vitro

2.2 34種中草藥對副溶血弧菌FHBX-1的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度

由表3可知，黃連、蘇木、烏梅、五倍子、地榆、黃柏等10 種單方中草藥對副溶血弧菌FHBX-1 的MIC為 3.91～31.25 mg/mL，MBC為 7.81～62.50 mg/mL；石榴皮、虎杖、牡丹皮等19 種單方中草藥的MIC為62.50～125 mg/mL，MBC為125～250 mg/mL；石菖蒲、金櫻子、杜仲等5種單方中草藥的MIC均為250 mg/mL，MBC均為500 mg/mL。

表3 34種中草藥對副溶血弧菌FHBX-1的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度Table 3 The minimum bacteriostatic concentration（MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC） of 34 kinds of Chinese herbal medicines on V.parahaemolyticus FHBX-1

綜合單方中草藥抑菌圈直徑、MIC、MBC試驗結果可知，黃連、烏梅、蘇木、五倍子、地榆、黃柏6種單方中草藥對副溶血弧菌FHBX-1的體外抑制效果較好，可作為復方中草藥配伍的備選藥物。

2.3 中草藥聯合對副溶血弧菌FHBX-1 的體外抑菌效果

以黃連、烏梅、蘇木、五倍子、地榆、黃柏抑菌效果較好的6 種中草藥，組成15 組復方進行試驗。由表4 可知，15 組復方中草藥對副溶血弧菌FHBX-1的抑菌圈直徑均大于15.00 mm，其中副溶血弧菌FHBX-1對黃連+蘇木、烏梅+黃連、黃柏+黃連等10 組為極度敏感，抑菌圈直徑均大于20.00 mm；對黃連+地榆、蘇木+黃柏、地榆+蘇木等5組為高度敏感，抑菌圈直徑為15.40～19.38 mm。

表4 中草藥聯合對副溶血弧菌FHBX-1的體外抑菌效果Table 4 The bacteriostatic effect of Combined Chinese herbal medicines on V.parahaemolyticus FHBX-1 in vitro

2.4 中草藥聯合對副溶血弧菌FHBX-1 的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度

由表5 可知：15 組復方中草藥對副溶血弧菌FHBX-1 的體外抑菌作用各不相同，其中黃連+蘇木組對副溶血弧菌的MIC為1.95 mg/mL，MBC為3.91 mg/mL，聯合抑菌指數（FICI）為0.50，表現為協同作用；黃連+烏梅、黃柏+五倍子、黃連+黃柏組的MIC均為3.91 mg/mL，MBC均為7.81 mg/mL，FICI為0.63～1.00，表現為相加作用；烏梅+黃柏、烏梅+五倍子、蘇木+ 五倍子組的MIC為3.91～7.81 mg/mL，MBC為7.81～15.63 mg/mL，FICI為1.06～2.00，表現為無關作用；黃連+地榆、烏梅+地榆、蘇木+ 黃柏等8 組的MIC為7.81～62.50 mg/mL，MBC為15.63～125.00 mg/mL，FICI為2.06～4.00，表現為拮抗作用。

表5 中草藥聯合對副溶血弧菌FHBX-1的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度Table 5 The minimum bacteriostatic concentration（MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC） of Combined Chinese herbal medicines on V.parahaemolyticus FHBX-1

綜合中草藥聯合應用的抑菌圈直徑、MIC、MBC試驗結果可知，黃連+蘇木組對副溶血弧菌FHBX-1的抑菌效果最好，抑菌圈直徑高達28.74 mm，MIC與MBC分別為1.95、3.91 mg/mL，顯著優于單一抑菌活性最高的黃連（抑菌圈直徑為25.41 mm，MIC為3.91 mg/mL、MBC為7.81 mg/mL）。

3 討論

水產動物病害綠色防控是水產養殖業可持續健康發展的必然趨勢［24］。中草藥作為天然草本植物，富含生物堿、有機酸、黃酮類、苷類、多糖等多種抑菌活性成分，能夠通過破壞細菌細胞膜的完整性和通透性、影響細菌核酸和蛋白質合成等機制發揮抗菌作用，具有低毒、高效、不易產生耐藥性，提高水產動物抗病力等優點［25-26］。因此，利用中草藥替代抗生素防治水產動物細菌性疾病具有廣闊的應用前景。

近年來，有關學者開展了中草藥對不同來源副溶血弧菌的體外抑菌效果相關研究。任海等［16］報道，黃連對大菱鲆源副溶血弧菌的抑菌圈直徑為25.00 mm，最小抑菌質量濃度（MIC）為1.56 mg/mL；夏與晴等［18］研究顯示，黃連對草魚源副溶血弧菌具有良好的抑菌效果，抑菌圈直徑達26.51 mm。本試驗結果顯示，黃連對凡納濱對蝦源副溶血弧菌FHBX-1 的體外抑菌活性最強，抑菌圈直徑達25.41 mm，最小抑菌質量濃度（MIC）為3.91 mg/mL，與上述研究結果相近。梁利國等［27］研究發現，五倍子、蘇木、石榴皮對副溶血弧菌的抑菌效果顯著，最小抑菌質量濃度（MBC）均為3.12 mg/mL；張磊［28］報道，黃柏、苦參等中草藥對克氏原鰲蝦（Procambarus clarkii）源副溶血弧菌有明顯抑制作用；任海等［16］研究顯示，蘇木、烏梅、地榆中草藥對大菱鲆源副溶血弧菌具有較強抑菌活性，抑菌圈效果均為高度敏感，最小抑菌質量濃度（MIC）均為3.13 mg/mL。本試驗分析了40 種單方中草藥對凡納濱對蝦源副溶血弧菌FHBX-1的體外抑菌效果，發現黃連、烏梅、蘇木、五倍子、地榆、黃柏等中草藥對副溶血弧菌FHBX-1 的體外抑菌作用較強，抑菌圈直徑均達20.00 mm 以上，最小抑菌質量濃度（MIC）為3.91～31.25 mg/mL，最小殺菌質量濃度（MBC）為7.81～62.50 mg/mL。本試驗結果與上述學者的研究結果相似，這表明黃連、烏梅、蘇木、五倍子、地榆、黃柏等中草藥對副溶血弧菌的抑制作用具有一定的普遍性，其富含的抑菌成分（生物堿、鞣質、有機酸等）抑菌作用顯著。另外，本試驗結果顯示，副溶血弧菌FHBX-1對板藍根、黃芪、蘆根等中草藥不敏感，與王玉娥等［17］研究發現的海洋致病性副溶血弧菌對板藍根敏感的結論不一致，這可能與菌株來源、中草藥產地以及中草藥提取工藝不同等因素相關［29］。

Aggarwal 等［30］研究認為，抗菌藥物的抑菌圈直徑越大則最小抑菌質量濃度越小。本試驗中地榆、苦參、大黃3種單方中草藥的體外抑菌結果顯示，地榆與苦參的抑菌圈直徑均大于20.00 mm 為極度敏感，但苦參的最小抑菌質量濃度（MIC）為125.00 mg/mL，而地榆的最小抑菌質量濃度（MIC）卻為15.63 mg/mL，僅為苦參質量濃度的1/8；地榆與大黃的最小抑菌質量濃度（MIC）均為15.63 mg/mL，但大黃的抑菌圈直徑為12.41 mm，僅為地榆抑菌圈直徑的1/2，這種試驗現象與Aggarwal等的觀點不一致，可能與藥液在不同介質中擴散能力與菌 - 藥有效接觸面積相關［31］。本試驗結果表明，僅依據抑菌圈直徑大小來判斷中草藥的抑菌效果的強弱可能存在一定局限性，在篩選中草藥時需參考抑菌圈直徑、最小抑菌質量濃度（MIC）、最小殺菌質量濃度（MBC）等參數綜合判斷。本試驗綜合了抑菌圈直徑、最小抑菌質量濃度（MIC）、最小殺菌質量濃度（MBC）試驗結果，篩選出了黃連、烏梅、蘇木、五倍子、地榆、黃柏6種具有較強綜合抑菌活性的中草藥，作為凡納濱對蝦源副溶血弧菌防治的復方配伍備選中草藥。

楊培奎等［32］認為，將兩種或兩種以上中草藥進行合理配伍，利用不同藥物間的協同作用，共同作用于水產致病菌具有顯著提高中草藥抑菌、殺菌的效果。王寶屯等［24］發現，將烏梅和丁香進行配伍制成復方中草藥，該復方中草藥對花鱸源維氏氣單胞菌的抑菌圈直徑為22.50 mm，較烏梅、丁香單用時的抑菌圈直徑（21.44、17.11 mm）有明顯擴大；夏與晴等［18］將烏梅和白頭翁進行配伍制成復方中草藥，發現該復方中草藥對草魚源熒光假單胞菌的MIC降低至7.81 mg/mL ，較烏梅、白頭翁單用時的MIC（15.63、62.50 mg/mL）顯著減小。這些研究表明，不同中草藥之間進行科學的配伍能夠產生顯著的協同抗菌作用［33］，本試驗中發現15組復方中草藥對副溶血弧菌FHBX-1的抑菌圈直徑均大于15.00 mm，較單方中草藥抑菌效果更為穩定，其中黃連+蘇木組的抑菌活性最高，對副溶血弧菌FHBX-1 的抑菌圈直徑達28.74 mm，MIC為1.95 mg/mL，顯著優于黃連、蘇木單用時的抑菌圈直徑（25.41、23.00 mm）與MIC（3.91、7.81 mg/mL），究其原因，可能是因為黃連富含小檗堿、黃連堿、甲基黃連堿等活性物質，通過破壞細菌的細胞膜和細胞壁的結構，抑制糖代謝達到抑菌的作用［34］；蘇木富含巴西蘇木素抑菌活性成分，可通過抑制細菌生物膜的形成起到抑菌效果［35］，兩者配伍時藥效相互補充起到增效抗菌的作用［22］。另外，本試驗也發現烏梅+蘇木組對副溶血弧菌FHBX-1 的抑菌作用顯著弱于烏梅、蘇木單用時的抑菌效果，與王寶屯等［24］研究結論一致，可能與藥性相殺或相畏的中草藥進行配伍時產生拮抗作用，造成藥效減弱有關。因此，中草藥之間進行復方時需嚴格按照科學的配伍原則，讓中草藥配伍起到“協同”作用，以增強復方中草藥制劑的體外抑菌效果，這也將是提升水產用抗菌中草藥制劑應用一個重要突破口。

4 結論

40 種單方中草藥對副溶血弧菌FHBX-1 的體外抑菌效果存在一定差異，其中以黃連、烏梅、蘇木、五倍子、地榆、黃柏6種單方中草藥綜合抑菌作用較強。中草藥聯合應用以黃連+蘇木對副溶血弧菌FHBX-1 抑菌和殺菌效果最好，聯合抑菌指數顯示為協同作用。結果表明中草藥黃連+蘇木聯合應用對凡納濱對蝦源副溶血弧菌具有較強的體外抑菌和殺菌作用，可為進一步開發高效、安全、環境友好型的水產用中草藥制劑提供參考依據。