一種消炎復合物的體外抑菌與燙傷愈合作用

陶宣伊，戚思薇，朱翔宇，包哲隈，2，楊靖亞，2

（1. 上海海洋大學食品學院，上海 201306；2. 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

燒、燙傷在日常生活中十分常見，存在疼痛、易感染、愈后產生疤痕等問題［1］。一般來說，燒燙傷分為3個級別，Ⅰ度燙傷即紅斑性燙傷，Ⅱ度燙傷即水泡性燙傷，Ⅲ度燙傷即焦痂性燙傷，其中Ⅱ度燙傷可分為淺Ⅱ度燙傷和深Ⅱ度燙傷［2］。臨床治療燙燒傷以抗感染、止痛、促進皮膚再生在為主，由于破壞了皮膚表面屏障，其創面易滋生細菌［3］，處理后殘留的小創面仍有可能會反復破潰而不愈合，患者皮膚創面抵御微生物入侵能力下降［4］，細菌入侵并大量繁殖而引發化膿感染等會使得治療更加困難，影響患者康復。

研究顯示燒傷病房送檢標本中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）檢出率較高，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）占比高［5］，具有多重耐藥性。耐藥菌產生問題的發生與發展源于抗生素的長期使用［6］，其中燒傷外科在感染防治方面面臨巨大挑戰［7］，促使治療效果過早衰退。S.aureus為革蘭氏陽性菌，可導致傷口感染和葡萄球菌燙傷皮膚綜合征等常見的S.aureus感染性疾?。?］。燒傷創面常用含抗生素藥物外敷，研究顯示創面S.aureus對青霉素［9］、紅霉素［10］耐藥性高。通過研究天然產物，從中提取有效抗菌成分作為天然藥物來研究抗生素類物質，可緩解新型抗生素研發的壓力，為開發新型藥物提供可能［11］。

在我國仙人掌屬植物藥用在《中藥大辭典》中早有記載，作為一種中藥藥材，其具有活血化瘀、清熱解毒、止痛消腫的功效［12］。仙人掌的醇提液對銅綠假單胞菌以及變形桿菌等均有抑制作用，且對S.aureus有明顯抑制效果［11］，在臨床上對由S.aureus引起的感染采用含仙人掌成分的藥物治療，取得了較好的成效。Shimaa 等［12］的試驗經HPLC 分析，在仙人掌中觀察到8種酚類和黃酮類化合物的存在，酚類主要成分是兒茶素，其次是沒食子酸、咖啡酸、綠原酸和酚酸，黃酮類化合物如槲皮素、山柰酚和蘆丁。仙人掌提取物具有促進創面愈合作用［13］，可作用于燙傷小鼠。有研究發現，仙人掌在傷口愈合過程的各個階段，如細胞-細胞、細胞-基質相互作用或膠原合成中檢測到有益的皮膚修復活性［14］且臨床上仙人掌制品對早期和中期流行性腮腺炎有治療效果［16］。主要從仙人掌果實和莖中提取的仙人掌多糖（opuntia dillenii polysaccharide，ODP）是其有諸多功效的主要原因之一［17］，而約占仙人掌總質量40%的外皮常作為垃圾處理，但研究顯示米邦塔仙人掌表皮及果肉提取物均含有黃酮類成分，且表皮提取物含總黃酮量高于果肉提取物［18］。茶多酚又名茶鞣質或茶單寧，主要包括兒茶素、黃酮、花青素和酚酸等4類化合物［19］。茶多酚能夠使得細菌正常形態改變［20］、使細菌細胞出現了不同程度的聚集和穿孔、破壞損傷細胞膜和細胞壁［22］，以及影響菌體基因的正常表達，抑制蛋白質的合成和表達［23］等，從而發揮抑菌效果。茶多酚還可降低創面的炎癥反應，加速創傷修復，促進創面表皮再生［24］，能夠加速創面修復的天然原材料，并具有具有良好生物安全性。蜂膠有破壞細菌細胞膜的通透性、抑制病原體入侵宿主細胞所需的酶和蛋白質的合成、破壞病原體入侵宿主細胞的能力等［25］，可顯著抑制對甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌（MRSA）的繁殖［26］。茶多酚、仙人掌、蜂膠都具有抑菌抗炎活性，產生協同增效作用，能充分發揮天然化合物的優勢。

本研究以茶多酚、仙人掌和蜂膠以質量比2∶1∶1［27］制備一種消炎復合物，進行體外抑菌試驗測試其抑菌活性，并構建小鼠燙傷模型測試該消炎復合物對于小鼠燙傷創面的治療作用。

1 儀器與材料

1.1 試驗儀器

SYNERGY2 型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；SW-CJ-1F 型單人雙面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；85-2 型恒溫磁力攪拌器（上海思樂儀器有限公司）；試驗用電磁爐（Midea）

1.2 材料和菌株

仙人掌粉（河南裕英信息技術有限公司，純度≥95%）；茶多酚粉（鄭州蒼宇化工產品有限公司，含量98%）；蜂膠粉（福建省龍巖市滿兜兜商貿有限公司，純度≥95%）；大腸桿菌（Escherichia coli，由上海海洋大學微生物實驗室提供）；金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，由上海海洋大學微生物實驗室提供）；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，由上海海洋大學微生物實驗室提供）；燙傷膏（廣舒平）

1.3 試劑和藥品

羧甲基纖維素鈉800～1 200 mPa·s（國藥集團化學試劑有限公司）；三醋酸甘油酯（上海麥克林生化科技有限公司）；果膠（上海麥克林生化科技有限公司）；牛肉膏（上海麥克林生化科技有限公司）；胰蛋白胨（上海麥克林生化科技有限公司）；瓊脂粉（上海麥克林生化科技有限公司）；氯化鈉（上海展云化工有限公司）；氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇（上海麥克林生化科技有限公司）；硫化鈉九水合物（上海麥克林生化科技有限公司）；無水乙醚（俊秀牌）

1.4 試驗動物

昆明鼠，體質量23～28 g，性別均為雌性。購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010

1.5 試驗方法

1.5.1 消炎復合物溶液的制備

稱取羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），加入約60°C的蒸餾水中，邊攪拌邊緩慢加入，配制1%的CMCNa溶液，待溶液溶脹澄清，結塊消失后則制作完畢。取茶多酚粉、仙人掌粉、蜂膠粉，質量比為2∶1∶1，依次緩慢倒入100 mL 1% CMC-Na溶液溶解，并不斷用磁力攪拌器加熱攪拌，分別配制成100、80、40 mg/mL 的溶液，定容后加入果膠和三醋酸甘油酯，混勻，配置完成后過濾除菌。原料用量見表1。

表1 消炎復合物的不同配方Table 1 Different formulas of the anti-inflammatory compound

其中100 mg/mL 濃度的消炎復合物溶液用于體外抑菌試驗；80、40 mg/mL 濃度的消炎復合物溶液分別作為小鼠燙傷試驗高濃度組、低濃度組給藥濃度。

1.5.2 抑菌試驗材料制備與抑菌測定

1.5.2.1 培養基的制備 按培養基配方依次準確稱取牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL 加入燒杯中，加熱至完全溶解后加入瓊脂粉，繼續加熱使瓊脂溶解不斷攪拌。材料溶解后將pH調至7.3～7.6，分裝至試管內或三角燒瓶內（每個錐形瓶倒入100～150 mL 培養基，使滅菌完全），在103.43 kPa，121 ℃下高壓滅菌20 min。滅菌后趁熱倒平板和斜面，將6支裝有培養基的試管傾斜放置，制成斜面。剩余培養基倒成平板，備用。

1.5.2.2 菌懸液的制備 采用平板計數法［28］計算菌落個數，取每個濃度梯度的菌懸液200 μL 轉移至平板上，涂布均勻，每種菌每個濃度重復3次，倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。

菌液濃度（CFU/mL）=［3 個平板的總菌落數/3］×5×稀釋倍數

將每種菌種挑取4環，稀釋梯度，根據已經繪制的菌數-吸光值標準曲線制備相應濃度的菌懸液，分別用接種環從斜面上挑取1環至10 mL生理鹽水中，得到3種菌的菌懸液母液。測得金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌3 種菌懸液的母液吸光值為0.361、0.340、0.341，經過稀釋法稀釋菌液后得到吸光值為0.051、0.052、0.052 的菌懸液，約為標準曲線中的濃度為1×106的菌懸液。本試驗中所需供試液濃度為106CFU/mL。

1.5.2.3 抑菌作用的測定 1） 濾紙片擴散法 本試驗采用濾紙片擴散法［28］檢測消炎復合物的抑菌活性。制備若干直徑6 mm的圓形濾紙片，高溫滅菌備用。將濾紙片完全浸沒在消炎復合物液體中，靜置5 min。將1個培養單種菌種的培養基分為4個區，中間1 個對照組，其它3 個為相同濃度的藥物組，相當于每種細菌的同種藥物濃度平行做3組試驗，結果取均數±標準差（-x±s，cm）。使用移液槍轉移200 μL菌液至培養皿中，涂布均勻，放置1 min 后貼上吸收消炎復合物液體的濾紙片，用浸入75%乙醇的濾紙片為對照，放置在培養基中央。細菌置于37 ℃的培養箱中培養24 h后查看抑菌圈情況。

2） 最小抑菌濃度（MIC）的測定 將“2.1”項下制備好的100 mg/mL 溶液用二倍稀釋法［30］制備濃度分別為1、5、10、20、40、80、100 mg/mL的消炎復合物溶液，分別浸入直徑為6 mm 的圓形已滅菌的濾紙片。按照濾紙片擴散法進行最小抑菌濃度的測定，將細菌置于37 ℃培養箱培養24 h 后測量抑菌圈直徑。每種供試菌、每個濃度的復合物溶液重復3次試驗，取平均值。規定最小抑菌濃度為首次出現抑菌圈的最小濃度。

1.5.3 小鼠燙傷試驗

1.5.3.1 小鼠燙傷模型的建立 于建模前1 d用電動剃毛器將小鼠背部毛發剪短，使用8%硫化鈉溶液［31］作為脫毛劑。建模時把小鼠與浸入乙醚的棉球投入玻璃缸中，待小鼠停止活動即為輕度麻醉。將小鼠轉移至工作臺上，膠帶固定頸部以防燙傷過程中小鼠蘇醒掙扎。使用加熱的砝碼［32］作為燙傷物，將2個10 g砝碼放入鍋內與熱水同時加熱，待水沸騰后維持10 min，用鑷子把砝碼夾出，迅速放置于小鼠背部皮膚上并輕微施加壓力，持續10 s即可建立淺Ⅱ度燙傷模型。

1.5.3.2 分組和給藥 建立小鼠燙傷模型后觀察48h，待傷口穩定后給藥，選取12只傷口大小相近的小鼠，分為高濃度組（80 mg/mL）、低濃度組（40 mg/mL）、燙傷膏組（陽性對照）和生理鹽水組，每組3只，每組飼養于同一鼠籠。高濃度組、低濃度組和燙傷膏組小鼠每次換藥前用生理鹽水棉球清洗傷口并擦干，再用棉簽蘸取相應藥物在小鼠背部創面上涂抹均勻，作用1 min 后蓋上一層紗布，對應給藥劑量為0.2 g/個傷口；生理鹽水組用生理鹽水浸濕棉球，涂抹于小鼠創面。每組小鼠每天給藥2次，早晚各1次，持續10 d，期間自由飲食。

1.5.3.3 促燙傷創面愈合功能檢測 于給藥后第1、4、7、10天記錄創面面積。在小鼠旁放置尺子作為比例尺，拍照，將照片導入Photoshop 計算創面面積［33］，記錄后計算創面愈合率。

創面愈合率（%）=（原始創面面積－未愈合創面面積）/原始創面面積×100%

1.5.3.4 臟器系數測定 臟器系數即試驗動物某臟器的質量與體質量的比值，是毒理試驗中常用的指標，在本試驗中用于檢驗消炎復合物對小鼠有無毒性。于給藥后第10天記錄創面面積后稱量每只小鼠，完成后進行處死并解剖。取小鼠心、肺、肝、脾、肺、腎臟，分別稱質量。

臟器系數（%）=（某臟器質量/小鼠體質量）×100%［34］

1.6 數據分析

將創面愈合率和臟器系數數據導入SPSS statistics 21.0 進行分析，結果以-x±s表示，進行組間顯著性分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的消炎復合物對3 種細菌的抑菌作用

試驗過程中消炎復合物以及75%酒精對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑見表2。

表2 消炎復合物及75%酒精對各供試菌株的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of bacteriostatic circle of the anti-inflammatory compound and 75% alcohol on all tested strains

從表2的數據中可以分析出，消炎復合物對3種供試菌的抑菌效果皆存在量效關系，即消炎復合物濃度越大，抑菌圈直徑越大，抑菌效果越強。因此，消炎復合物對3種菌的抑菌效果強弱為：金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌。

2.2 消炎復合物對3 種細菌的最小抑菌濃度（MIC）測定結果

試驗得出了其對3種細菌的最小抑菌濃度見表3。對于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，二者都在消炎復合物濃度為40mg/mL時首次出現抑菌圈，而對于金黃色葡萄球菌，消炎復合物濃度為10 mg/mL時出現抑菌圈。因此，該消炎復合物對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的MIC為40 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC為10 mg/mL。

表3 消炎復合物對3種細菌的最小抑菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentration of the antiinflammatory compound on three kinds of bacteria

2.3 小鼠創面變化觀察

2.3.1 小鼠燙傷創面變化 砝碼接觸小鼠背部皮膚后，燙傷處皮膚立即變白。燙傷后近似白色的圓形，與周圍皮膚有明顯的區別。各組小鼠燙傷創面變化如圖1，分別為生理鹽水組、低濃度組、高濃度組以及燙傷膏組在1 d 時和給藥10 d 時得燙傷創面變化。圖中可看出燙傷后24 h，燙傷處傷口全部潰破，傷口顏色呈較深的粉紅色，傷口平坦，與周遭皮膚并無高低差異。在給藥10 d 時，各小鼠痂皮大面積縮小，基本脫落，其中高濃度組創面變化最大，治療效果最好。

圖1 小鼠燙傷創面Figure 1 Changes of scalded wound of mice

2.3.2 小鼠各組創面愈合率比較 試驗過程中各組創面愈合率數據經統計學處理后的結果見表4。各組創面愈合率比較見圖2。創面愈合標準：正常皮膚和創面邊界出現深粉紅色肉芽，表面光滑，與暗紅色的創面有顯著區別，即可認為已經愈合。從表4、圖2的數據中可以分析出，各組小鼠的創面恢復情況隨著給藥天數的增加而好轉，創面愈合率持續上升。

圖2 小鼠創面愈合率Figure 2 Comparison diagram of wound healing rate in mice

表4 各組小鼠創面愈合率比較Table 4 Comparison of wound healing rate of mice in each group±s，%

表4 各組小鼠創面愈合率比較Table 4 Comparison of wound healing rate of mice in each group±s，%

與生理鹽水組相比，*P＜0.05表示有顯著性區別。Compared with the normal saline group， * P＜0.05 indicates a significant difference.

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2.4 小鼠行為觀察

燙傷前各組小鼠行為活躍，經常出現倒懸于籠蓋上的活動，燙傷后該行為消失，小鼠活動減少，睡眠時間變多。給藥3～7 d 期間，隨小鼠燙傷創面情況轉好，小鼠該行為又重新出現，并且小鼠出現偏好鉆入墊料中的行為，推測出現這一現象的原因系脫毛、毛發減少導致的體溫維持性能下降。

本試驗給藥時采用棉簽或棉球涂抹創面的方式，在給藥過程中棉簽或棉球將與創面發生摩擦，使小鼠疼痛而產生不同程度的掙扎，生理鹽水組的小鼠掙扎幅度最大，有后縮的現象，因此推測該組小鼠創面疼痛程度最大。且在經過1周的給藥后，其余組的小鼠在給藥時較為安定，而生理鹽水組小鼠反應仍較為強烈。初步推定，在給藥治療小鼠促進燙傷創面恢復的過程中，消炎復合物以及燙傷膏給藥后創面恢復程度較生理鹽水組高，給藥后疼痛程度降低，使小鼠行為安定。

2.5 消炎復合物對小鼠內臟的影響

2.5.1 臟器系數測定結果 各組小鼠各主要臟器的臟器系數見表5。分析表5 可知消炎復合物組各臟器系數與生理鹽水組沒有顯著性區別，初步判斷其對小鼠主要臟器無毒性作用。

表5 各組小鼠的臟器系數比較Table 5 Comparison of organ coefficients of mice in each group±s，%

與生理鹽水組相比，*P＜0.05表示有顯著性區別。Compared with the normal saline group， * P＜0.05 indicates a significant difference.

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2.5.2 大體解剖結果 小鼠經大體解剖后取出心、肝、脾、肺、腎臟，進行肉眼觀察，見圖3。觀察各小鼠的主要臟器，與正常小鼠的臟器比較，并無明顯差異。

圖3 小鼠大體解剖Figure 3 Gross anatomy of mice

3 討論

本試驗配置了4種仙人掌消炎復合物液體：（1）300 mg/mL：該組溶液過于濃稠，粉末狀溶質相較于溶劑過多，粉末無法均勻分布在溶液中，且流動速度極慢，無法倒入容量瓶內準確配制；（2） 200 mg/mL：該濃度溶液較（1）略微改善了問題，但是與（1）相同，粉末無法均勻分布在溶液中，流動速度極慢，無法倒入容量瓶內準確配制；（3） 100 mg/mL：該濃度溶液流動性適中，3種粉末可以均勻分布在溶液內部，易倒入容量瓶進行定容等操作，加入果膠后復合物狀態呈粘稠狀，粘度適中，質地均勻；（4） 100 mg/mL：該組溶液與（3）相比雖然3種粉末可以均勻分布在溶液內部，易倒入容量瓶進行定容等操作，但流動性較差，加入果膠后復合物狀態過于黏稠，2%CMC-Na溶液與果膠交聯性過強，無法混合均勻，質地粗糙。通過外觀判斷并綜合了4種溶液的黏稠度和性狀之后決定了本次試驗中所使用的仙人掌消炎復合物溶液均由表1中100 mg/mL配方制成。

體外抑菌試驗研究驗證，對照組的75%乙醇對以上3種細菌的抑菌圈大小均為0.8 cm左右，所以消炎復合物在最小抑菌濃度下的抑菌活性較好，相當于75%乙醇的抑菌活性程度。從張文［11］等的試驗中可以得出，仙人掌的水煎液（148 mg/mL）與醇提取液（387 mg/mL）對金黃色葡萄球菌的MIC分別為74 mg/mL 和12 mg/mL。郗慧芝［35］等的試驗中，100 mg/mL濃度的仙人掌水煎液與醇提液對于金黃色葡萄球菌的MIC分別為88 mg/mL和59 mg/mL。對比本試驗中消炎復合物溶液（100 mg/mL）對金黃色葡萄球菌的MIC為10 mg/mL，可初步認為，對于金黃色葡萄球菌的抑制能力由大到小排序為：消炎復合物＞仙人掌醇提取液＞仙人掌水煎液。

小鼠燙傷試驗中與生理鹽水組小鼠相較而言，高濃度、低濃度消炎復合物組和燙傷膏組在給藥的前4 d 并無顯著性差異，而隨著時間推移高濃度組、低濃度組和燙傷膏組在第7、10天時創面愈合率明顯高于生理鹽水組，均具有顯著性差異（P＜0.05）。第7、10天時，高、低濃度消炎復合物組的創面愈合率均值與燙傷膏組相近，這表明該消炎復合物具有與燙傷膏相當的治療燙傷創面的作用，然而第10天前高濃度組和低濃度組相較于燙傷膏組數據來說標準差略大，這意味著此消炎復合物對小鼠燙傷創面的治療作用可能不如燙傷膏穩定。因此，為了評價此消炎復合物長期使用的安全性及穩定性，我們進行了小鼠的大體解剖并計算其臟器系數。臟器系數常在動物毒理學實驗中作為一種生理指標，臟器重量發生的變化反應化學物質的毒性大小和效應［36］。本試驗用高、低濃度消炎復合物對小鼠進行給藥，試驗過程中未見小鼠死亡，其飲水、進食、活動、步態等均基本正常，鼻、眼無異常分泌物，未見呼吸困難等異常改變，未見嘔吐、腹瀉等胃腸道反應。于給藥后第10天記錄創面面積后稱量每只小鼠，完成后進行處死并解剖，取小鼠心、肺、肝、脾、肺、腎臟，分別稱質量，計算小鼠臟器系數，由試驗結果已知，消炎復合物較生理鹽水對照組沒有顯著性區別，可認為其無明顯毒性。

在邵杰等的試驗中，磺胺嘧啶銀（AgSD）具有體外抑菌以及燙傷創面愈合的雙重作用［37］，為減少菌種抗生素耐藥性提供新的方法與材料，與本試驗目的一致。其試驗中粗粉AgSD的MIC=16 mg/mL，納米AgSD 的MIC=8 mg/mL，在未涂菌的納米AgSD凝膠組小鼠的深Ⅱ度燙傷創口愈合率在第2周達到最佳。對比本試驗，消炎復合物對金黃色葡萄球菌的MIC=10 mg/mL，抑菌能力有待提高，可進一步研究復方的組分，提高抑菌能力，進而達到提高創面治療抗感染的能力。本試驗低濃度組（40 mg/mL）、高濃度組（80 mg/mL）均給藥0.2 g/d/只，在第10 天，創面愈合率就達到（96.25±3.89）%和（94.60±5.72）%，可見消炎復合物對于燙傷創面愈合能力強，用藥量較少，且無不良反應，可初步認為消炎復合物能在燙傷治療中增強患者順應性，減少長期用藥帶來對身體的損傷。該消炎復合物提供了在燙傷創面受耐藥性金色葡萄球菌感染恢復的非抗生素藥物治療可能性，實現抗感染與創面愈合的雙重作用，且對于茶多酚組合仙人掌醫用產品的開發提供了科學的依據和資料。本研究中仙人掌具有低的抗藥性和提取成本，因不同仙人掌以及同種仙人掌的不同部位的物質活性差異［17-18］和使用的提取方法不同，可影響其藥物利用度和治療效率，若從中選擇最優仙人掌品種并挑取其抗炎物質活性最高的部位，使用樣品利用率高的提取方法來提取復合物的原料，可提高消炎復合物的抗菌以及燙傷創口治愈效果。

4 結論

綜上，本試驗使用100 mL 1%的CMC-Na溶液與茶多酚粉、仙人掌粉、蜂膠粉（質量比為2∶1∶1）制成的消炎復合物進行了體外抑菌試驗，表明其對金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，MIC為10 mg/L；并進行了小鼠燙傷試驗，其中高濃度組創面愈合能力強，治療效果與燙傷膏相當，但穩定性不如燙傷膏。小鼠行為觀察、臟器系數的測定以及大體解剖的結果可初步表明，該消炎復合物無明顯毒副作用，具有一定安全性。對于易被金黃色葡萄球菌感染的燙傷創面，本次研究制成的消炎復合物中含仙人掌多糖、黃酮類化合物、茶多酚、蜂膠等抗菌消炎物質，初步驗證了其配合使用適量可宏觀上加速傷口愈合，證明其具有一定促進傷口愈合作用和抗菌的雙重作用，且用藥量較少，可提高患者順應性，為臨床治療燙傷而引起的創面感染耐藥菌治療提供新的可能性。