TLR4、TREM1 在肺曲霉菌病患者血清中的表達水平及其診斷價值

劉佳佳 陳思琪 崔魴

肺曲霉菌病(pulmonary aspergillus disease,PA)是由曲霉菌侵入肺組織所引起的深部真菌感染性疾病,其中危害最嚴重的類型是侵襲性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillus,IPA),病程進展快,病死率高,常發生在免疫抑制的病患中[1]。目前診斷PA的依據缺乏一定客觀性或獲取結果耗時久,尤其是IPA病情進展迅速,常規檢測手段易延誤治療時機[2-4]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)作為天然免疫模式識別受體,參與了煙曲霉感染宿主免疫防御[5-6]。髓樣細胞觸發受體1(triggering recepter expressed on myeloid cell 1 ,TREM1)是先天免疫效應細胞的模式識別受體之一,在煙曲霉的識別中發揮作用,可放大TLR4炎癥信號[7-8]。因此,本研究檢測TREM1、TLR4在肺曲霉菌病患者血清中的表達情況并探究其診斷價值,以期為早期臨床診斷曲霉菌感染提供一定參考價值。

資料與方法

一、 一般資料

經本院醫學倫理委員會審批(倫理審查批號:2022-K254),選取2021年9月至2023年3月在重慶醫科大學附屬第一醫院確診為肺曲霉菌病患者30例為研究對象(研究組),選取研究組中接受抗真菌藥物治療214天的患者16例為藥物治療組;同期本院健康體檢者 25例作為健康對照組,本院確診為肺部感染(非曲霉菌)患者30例為肺部感染對照組。 研究組納入標準:(1)均符合肺曲霉菌病診斷標準[2,9]。(2)患者年齡≥18歲。(3)臨床資料完整。(4)簽署知情同意書。排除標準:(1)合并敗血癥、膿毒癥、克羅恩病和潰瘍性結腸炎等慢性炎癥[10]。(2)合并心肌梗死、感染性心內膜炎、自身免疫性疾病如銀屑病、類風濕關節炎等[11]。健康對照組納入標準:(1)無發熱感染等癥狀。(2)年齡≥18歲。(3)心、肝、腎功能正常。(4)白細胞計數正常。肺部感染對照組納入標準:(1)符合肺部感染診斷標準。(2)無曲霉菌感染的臨床及病原學檢測依據。(3)年齡≥18歲。

二、 酶聯免疫吸附試驗( enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 檢測血清中TREM1、TLR4水平

肺曲霉菌病患者、健康體檢者、肺部感染(非曲霉菌)患者于入院當天、獲得診斷當天、體檢當天空腹抽取靜脈血5mL,室溫靜置1h,3000r/min離心10min,上清備用。嚴格按照人TREM1、TLR4 ELISA試劑盒(華美生物 cusabio 公司,產品編號分別為:CSB-E04836h,CSB-E12954h)說明書檢測血清中TREM1、TLR4水平。

三、使用AVIOS高通量流式細胞儀檢測血清Th1/Th2/Th17型相關細胞因子濃度(包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ)

肺曲霉菌病患者、健康體檢者、肺部感染(非曲霉菌)患者于入院當天、獲得診斷當天、體檢當天、肺曲霉菌患者服用抗曲霉菌藥物治療14天[12]后,空腹抽取靜脈血5mL,室溫靜置1h,3000r/min離心10min,上清備用。嚴格按照人Th1/Th2/Th17亞群檢測試劑盒(江西賽基生物技術有限公司)使用說明書檢測血清中Th1/Th17型相關細胞因子濃度。

四、統計學分析

結 果

一、基線資料

選取2021年9月至2023年3月在重慶醫科大學附屬第一醫院確診為肺曲霉菌病患者30例為研究對象(研究組),男 20例、女10例,年齡≥18歲、平均年齡(62.60±13.95)歲(見表1); 同期本院健康體檢者 25例作為健康對照組,男16例、女9例,年齡≥18歲、平均年齡(62.92±10.32)歲; 本院確診為肺部感染(非曲霉菌)患者30例為肺部感染組,男24例、女6例,年齡≥18歲、平均年齡(70.13±19.99)歲。各組間性別、年齡差異無統計學意義(χ2=0.043,F=2.198,P>0.05),具有可比性。

二、研究組、肺部感染組、健康對照組血清TREM1、TLR4水平情況

與健康對照組、肺部感染組相比較,研究組血清中TREM1、TLR4水平均升高(P<0.05)。肺部感染組與健康對照組血清中TREM1、TLR4水平相比較,差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

三、血清TREM1、TLR4水平對肺曲霉菌病患者的診斷價值

表1 研究組臨床資料

表2 研究組、肺部感染組、健康對照組血清中TREM1、TLR4水平比較

通過ROC曲線探究血清TREM1、TLR4水平對肺曲霉菌病患者的診斷價值。ROC曲線顯示,血清TREM1水平預測肺曲霉菌病的ROC曲線下面積為0.753(95%CI:0.608～0.897),截斷值為251.387 ng/L,其敏感度為56.67%,特異度為84.21%,準確度為 67.35% ;血清TLR4水平預測肺曲霉菌病的ROC曲線下面積為0.865(95%CI:0.761～0.969),截斷值為6.707 ng/mL,其敏感度為76.67%,特異度為89.47%,準確度為 81.63% ;兩者聯合預測肺曲霉菌病的ROC曲線下面積為0.898(95%CI:0.810～0.986),其敏感度為90.00%,特異度為78.95%,準確度為85.71%(見圖1)。血清TLR4水平與TREM1+TLR4 ROC曲線下面積差異無統計學意義(Z=0.944,P=0.345);與血清TREM1水平相比,TREM1+TLR4 ROC曲線下面積升高(Z=2.089,P=0.037)。血清TREM1水平敏感度、準確度均低于TREM1+TLR4(P<0.05)(見表3)。

圖1 血清TREM1、TLR4水平預測肺曲霉菌病的ROC曲線

表3 血清TREM1、TLR4水平及兩者聯合對肺曲霉菌病診斷價值的敏感度、特異度、準確度比較(%)

四、研究組、肺部感染組、健康對照組血清炎性因子比較

健康對照組與研究組血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平比較差異有統計學意義(P<0.05);健康對照組與肺部感染組血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平比較差異有統計學意義(P<0.05);肺部感染組與研究組血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表4);研究組用藥前與用藥后血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17水平比較差異有統計學意義(P<0.05)(見表5)。

表4 研究組、肺部感染組、健康對照組血清炎性因子比較

表5 研究組用藥前后血清炎性因子比較

討 論

PA患者在感染早期,其外周循環中即會出現各種炎癥因子的改變,可作為早期診斷備選生物標志物。且血清炎癥因子的檢測具有廉價、簡單,可操作性強、研究價值高,應用前景廣等優點,值得進一步研究探索[15-16]。TREM-1在含有曲霉菌肉芽腫中有表達,提示該受體可能參與宿主的抗真菌反應;進一步的研究表明,TREM-1在真菌感染的肺中調節對煙曲霉的免疫應答,明確揭示了TREM-1在真菌感染中的作用[17-18]。在曲霉菌感染患者體內,TLR4能夠識別受損組織和壞死細胞釋放的內源性病原分子,進而促進炎癥反應[5,19];而TREM-1作為煙曲霉炎癥反應的重要調節因子;可調節對感染的先天和適應性免疫反應,從而協同和放大TLR4介導的信號通路,誘導炎癥因子產生,加強炎癥反應過程[20-23];有研究指出TREM-1激活后與TLR4協同作用,通過激活核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、酪氨酸磷酸化來促進促炎細胞因子的產生,如 白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL- 12p40和腫瘤壞死因子α( tumor necrosis factor alpha,TNF-α )等[24-25]。因此本研究通過檢測血清TREM1、TLR4在肺曲霉菌病患者血清中的表達水平,以期早期發現肺曲霉菌感染患者,為患者治療提供一定參考依據。在本研究中肺曲霉菌病患者血清中TREM1、TLR4水平與健康對照組、肺部感染組相比升高,表現出高表達,且肺部感染組與健康對照組間差異無統計學意義(見表2);提示曲霉菌侵入肺組織后誘發機體炎癥反應,進而影響TREM1、TLR4水平。Bernal-Martínez L.等[7]研究中指出TREM1水平在IPA患者體內是升高的,與本研究結果相符 ;并通過進一步研究表明,患者血清中TREM1水平高于251.387ng/L、TLR4水平高于6.707 ng/mL在臨床上應該受到重視,提示患者感染肺曲霉菌病的概率升高;而且TREM1+TLR4 ROC曲線下面積高于血清TREM1 ROC曲線下面積,敏感度、準確度高于血清TREM1敏感度、準確度(見圖1、表3)。表明兩者聯合診斷可使診斷價值更高,綜合兩者指標對于提前診斷肺曲霉菌病更有價值。

曲霉菌入侵肺組織引起的免疫反應:呼吸道上皮細胞和吞噬細胞通過模式識別受體(PRRs) 識別曲霉菌表面上多種病原體相關分子模式(PAMPs),兩者識別后曲霉菌抗原被樹突狀細胞處理并遷移到局部淋巴結,隨后將真菌肽呈現給曲霉菌特異性的原始CD4+T細胞,并誘導其分化為輔助性T細胞亞群1(help T cell 1,Th1)細胞,輔助性T細胞亞群2(help T cell 2,Th2)細胞,輔助性T細胞亞群17(help T cell 17,Th17)細胞,這些效應細胞進一步分泌細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17等)來對抗曲霉菌感染[26-27]。中性粒細胞(Neutrophilicgranulocyte ,NEU)在機體對抗曲霉菌感染中也扮演著重要角色,由肺泡巨噬細胞或其他細胞(如上皮細胞、內皮細胞、NK細胞及樹突狀細胞)產生的前炎因子介導募集,通過氧化及非氧化途徑殺死出芽的煙曲霉孢子及菌絲[28]。因此本研究通過檢測肺曲霉菌病血清炎癥細胞因子水平來探究上述指標能否為曲霉菌感染的早期診斷和治療提供臨床依據。有研究指出,IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平在曲霉菌感染早期升高,IL-2、TNF-α、IFN-γ由Th1細胞分泌,主要介導細胞免疫應答,增加機體對曲霉菌的抵抗力;IL-4、IL-6、IL-10由Th2細胞分泌,主要介導體液免疫,抑制Th1型淋巴細胞介導的免疫應答;Th1、Th2細胞之間的平衡共同維護機體免疫功能正常狀態[29]。IL-17由Th17細胞分泌,而Th17細胞在IPA中的具有防御和破壞雙重作用,因患者的免疫狀態、免疫反應細胞、模式受體的不同而出現差異[30]。本研究中肺曲霉菌病患者血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平均顯著高于對照組,表明曲霉菌侵入機體后,激活機體免疫反應,誘導多種炎癥細胞因子的分泌;肺部感染組與研究組相比較患者血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平差異無統計學意義,肺部感染組上述炎性因子水平均高于健康對照組,差異有統計學意義;進一步研究表明肺曲霉菌病患者抗曲霉菌藥物治療14天后的血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17水平與抗曲霉菌藥物治療前相比均顯著降低,表明抗曲霉菌藥物治療兩周后,患者炎癥因子水平降低。故與其他病原體引起的肺部感染相比較,肺曲霉菌病患者血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平變化無特異性;而TREM1、TLR4在肺曲霉菌病患者血清中的變化具有特異性,故對于肺曲霉菌病的診斷具有一定價值。因肺曲霉菌病的早期診斷比較困難,在疾病早期大多提前采取經驗性用藥,故研究組可收集的標本量較少,并且目前關于TREM1和TLR4在肺曲霉菌病中的研究較少,所以本研究的結果僅作為臨床早期診斷肺曲霉菌病的一項參考指標,還需進一步擴大樣本量來驗證其診斷價值。

結 論

肺曲霉菌病患者血清中TREM1、TLR4水平升高,對臨床早期診斷肺曲霉菌病具有一定參考價值,且兩者聯合診斷可使診斷價值更高;血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平在肺曲霉菌病患者體內早期升高,可以反映肺曲霉菌病患者抗曲霉菌藥物治療的效果。本研究還存在一定局限性,未能動態監測上述指標在病程中的變化,而且還受到樣本例數的限制,因此擴大樣本量、動態監測上述指標變化是本研究接下來的研究重點。