阻斷PD-L1和MEK對非小細胞肺癌多細胞球體模型的治療作用

林吉興 云天洋 申磊磊 陳瑞驥 王柏霖 王鈺琦

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占所有肺癌的85%,多數患者被確診時已屬晚期;即使接受了根治性手術的患者,也很可能在幾年內復發并全身轉移[1]。過去的20年中,化療一直是無基因突變的NSCLC患者唯一的治療方法[2]。近年來,隨著對免疫系統與腫瘤細胞相互作用的進一步認識,免疫制劑抗細胞程序性死亡-配體1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)抗體藥物的療效已在多個不同的惡性腫瘤中得到證明[3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是一種重要的細胞內信號傳導通路,可將多種增殖和分化的信號傳遞到細胞外環境,研究顯示,腫瘤細胞中的MAPK活性增強可通過miR-675-5p上調PD-L1表達,而該通路的抑制可以通過抑制絲裂原活化的細胞外信號調節激酶1(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1,MEK1)和MEK2獲得[4-5]。本研究基于上述理論基礎,探討抗PD-L1抗體阿特珠單抗(Atezolizumab)和MEK抑制劑司美替尼(Selumetinib)在NSCLC多細胞球體(multicellular spheroid,MTS)模型中的抗腫瘤作用。

資料與方法

一、實驗材料及設備

收集2019年1月～2020年1月在我院接受手術的NSCLC患者的腫瘤樣本,納入標準:①有明確的NSCLC病理學診斷。②手術前未經過放療、化療及其它免疫靶向治療。③通過酶消化法進行處理,獲得體外MTS模型原代細胞培養。本研究方案經醫院機構評審委員會批準(S2022-40);患者均于術前簽署書面知情同意書。

實驗材料:10%優級胎牛血清(GIBCO),司美替尼(AZD6244)和阿特珠單抗(MPDL3280A)均來自Med Chem Express,MEK、MAPK和PD-L1初級抗體(武漢普諾賽),山羊抗兔IgG、兔抗小鼠IgG和單克隆抗β肌動蛋白抗體(武漢艾美捷)。

二、檢測指標及實驗方法

1 定量實時PCR

使用Trizol試劑(Life Technologies)提取總RNA。按照制造商說明使用SensiFAST(Bioline)通過逆轉錄酶反應將1μg分離的RNA轉化為cDNA。采用定量實時定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法分析PD-L1、IFN-γ、IL-12、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、TIM-3、CTLA-4、LAG-3基因的表達水平。利用PRIMER EXPRESS軟件(Applied Biosystems),所用引物(見表1)。使用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)進行擴增。熱循環條件為50℃升溫2 min(S1),95℃變性10 min(S2),然后在95℃升溫15s,60℃升溫1 min循環40次(S3)。所有樣本一式兩份,使用QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR系統(Applied Biosystems)進行,基因的相對表達量歸一至18S,作為內控基因;用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達值。通過解離曲線分析和使用非模板對照排除引物二聚體引起的非特異性信號。

表1 引物序列

2 蛋白質印跡分析

溶出物在RIPA緩沖液[0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),0.5%脫氧膽酸鈉,1%NP-40裂解液,100mmol/L NaCl,10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TRIS HYDROCHLORIDE,Tris-HCl)(pH=7.4),0.5 mmol/L二硫三醇,0.5%苯甲基磺酰氟,蛋白酶抑制劑(Hoffmann-La Roche)]中均勻化,離心15000 rpm/4℃,用Bio-Rad法測定蛋白質樣品,用增強型化學發光試劑ECL+檢測免疫復合物。每個實驗一式三份。

3 流式細胞術

流式細胞儀表面染色,用染色緩沖液(staining buffer,SB)(2%FBS;0.1%硝基苯甲酸鈉)洗滌細胞,用20%SB+Ab血清阻斷10 min后,用小鼠單克隆抗體染色30 min。所用抗體為:抗MEK、MAPK和PD-L1(Miltenyi Biotec)。染色細胞洗滌2次,再懸浮于SB中,然后在FACS ACCURI C6(BD Biosciences)上獲得。使用Accuri C6軟件(BD Biosciences)進行分析。用佛波醇-12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA,10 ng/mL)、放線菌素(500 ng/mL)和Brefeldin A(BFA 10 μg/mL)刺激6 h后,進行細胞內細胞因子產生分析,用小鼠單克隆抗體IFNG(Miltenyi Biotech)培育T細胞。

4 NSCLC MTS模型的制備

根據以往研究中NSCLC MTS模型的培養方案[6],將所有新鮮的腫瘤組織樣品保存在冰上,并在收集當天在無菌條件下進行處理。將組織碎片按DeRose所述[7]在37°C搖瓶中以低速至中速(200r/min)消化,培養12h～18h后通過連續離心分離細胞。將細胞接種在基質凝膠中以保留三維結構。

5 細胞生存能力分析

細胞活力采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)法測定,按照Morgillo所述進行MTS培養[8],MTT染色后用PBS-EDTA冷溶液從基質中提取細胞,根據說明進行裂解。通過劑量-響應曲線插值確定IC50,每次實驗均重復四次,使用三次獨立實驗的中位數作為結果,使用ComboSyn軟件計算協同作用。

三、統計分析

結 果

一、MTS模型中的培養

細胞培養共成功建立7個三維培養基,成功率為63.6%(7/11),患者特征及三維培養建立率(見表2),在基質凝膠中接種一周后,最小直徑90μm,在接下來的兩周內繼續生長,以便進行藥物測試。通過使用三種不同的過濾器(S1>100μm;S2 30～100μm;S3<30μm)過濾分離細胞,其中S3過濾球體的尺寸為最佳,將這一部分用于后續研究(見圖1)。

表2 患者特征及三維培養建立率[n(%)]

圖1 每次離心(S1、S2、S3)獲得球體模型的代表性圖像

二、MTS模型MEK、MAPK和PD-L1表達

對7個MTS模型進行MEK、MAPK和PD-L1的蛋白質印跡分析顯示,所有MTS模型MEK、MAPK和PD-L1均呈高表達水平(見圖2)。

圖2 MTS模型進行PD-L1、MEK和MAPK的蛋白質印跡分析,β-肌動蛋白作為對照

三、MTS模型對阻斷PD-L1和MEK的反應

將7種MTS模型分為空白組、阿特珠單抗組、司美替尼組和阿特珠單抗+司美替尼聯合應用組,結果阿特珠單抗組和司美替尼組產生中度抗增殖作用,司美替尼組組細胞死亡的中位數約為25%,阿特珠單抗組細胞死亡的中位數約為30%,聯合應用組表現出高度抗增殖效果,細胞死亡的中位數約為45%(見圖3)。

四、阻斷PD-L1和MAPK MTS模型細胞因子表達

通過RT-PCR處理后,聯合組IFN-γ、IL-12和IL-6的表達顯著增加(P<0.05),IL-10、IL-1β和TNF-α無明顯變化(P>0.05),司美替尼和阿特珠單抗組所有細胞因子均無明顯升高(P>0.05)(見圖4)。

圖3 MTS模型對阻斷PD-L1和MEK的反應

圖4 阻斷PD-L1和MAPK MTS模型細胞因子表達注:與未處理組比較,**P<0.01;***P<0.001

圖5 阻斷PD-L1和MAPKMTS模型免疫檢查點基因表達注:與未處理組比較,**P<0.01;***P<0.001

五、阻斷PD-L1和MEK的MTS模型免疫檢查點基因表達

RT-PCR處理后,聯合組PD-L1和CTLA-4表達顯著減少(P<0.05),TIM-3和LAG-3無明顯變化(P>0.05),司美替尼和阿特珠單抗組PD-L1表達顯著減少(P<0.05),CTLA-4、TIM-3和LAG-3表達均無明顯下降(P>0.05)(見圖5)。

討 論

針對PD-L1的免疫抑制劑改善了NSCLC患者的生存率,然而PD-L1表達和治療獲益之間的差異也經常出現。有研究表明,肺腺癌細胞中生長因子依賴的MAPK信號在IFN-γ誘導的PD-L1表達中起重要作用,MEK1/2抑制劑可降低IFN-γ誘導的PD-L1表達,增加肺腺癌細胞的免疫原性[6-7]。多項針對不同惡性腫瘤的動物實驗顯示,抑制MEK可通過防止T細胞凋亡,降低骨髓抑制細胞和調節性T細胞的水平來增強抗腫瘤免疫反應,當與PD-L1/PD-1阻斷治療結合時,可造成持續性的腫瘤抑制[8-9]。

在抗PD-L1藥物中,阿特珠單抗是一種工程化IgG抗體,其修飾的FC結構域可防止抗體依賴性細胞介導的細胞毒性,已被FDA批準用于NSCLC的二線治療[10]。有研究顯示[11],阿特珠單抗相比多西他賽化療延長了治療組和PD-L1陽性患者的生存率,說明無論PD-L1表達如何,阿特珠單抗均能顯示出一定的臨床療效。MAPK通路是一種重要的細胞內信號傳導通路,能夠將生理上多重增殖和分化的信號傳遞至細胞外環境。在腫瘤疾病中MAPK常會上調,導致不受控制的增殖、侵襲、轉移和血管生成。臨床前模型表明,靶向MAPK途徑能在更廣泛的程度上影響腫瘤生長。抑制MEK1和MEK2可抑制MAPK通路[12],司美替尼是一種強效和高選擇性的MEK抑制劑,目前與BRAF抑制劑威羅菲尼聯合應用于晚期BRAF突變的黑色素瘤患者[13]。此外,MAPK與免疫抵抗有關,抑制MEK可通過向腫瘤部位召集免疫細胞來轉化其它耐藥腫瘤[14]。

本研究使用體外多細胞培養物證明MEK抑制劑和抗PD-L1藥物在NSCLC細胞死亡方面具有顯著的協同作用。這種協同作用是MEK抑制劑對癌細胞的直接作用的結果,以及所有能夠維持免疫反應和炎癥微環境的細胞因子的誘導作用。有研究證明[15-16],在KRAS突變細胞中PD-L1上升,但對造成這種情況的下游途徑沒有完全闡明。Gao等[17]通過ERK信號證實KRAS突變背景下PD-L1的上調。有研究發現,STAT 3參與了RAS/MEK引起的PD-L1轉錄調控,為MEK抑制劑和抗PD-L1抑制劑的結合提供了另一個機制[18]。Liu等[19]研究顯示,在KRAS突變的NSCLC中,在蛋白質組和轉錄譜方面存在不同的亞組,包括對抗PD-1/PD-L1免疫治療耐藥的KRAS/LKB1突變患者,免疫和炎癥標志物表達低的KRAS/LKB突變患者,以及對單一免疫治療更敏感的KRAS/TP53突變患者。我們推測,在抗PD-1/PD-L1的基礎上加入MEK抑制劑對KRAS突變的患者也有幫助,也可以提高他們對免疫治療的敏感性。

使用患者特異性衍生MTS模型可以研究腫瘤細胞和T細胞之間的相互作用,識別概括人類白細胞抗原和T細胞受體的特異性[20],此外,通過類器官模型可對不同細胞成分的蛋白質和mRNA的表達進行研究,鑒定參與治療敏感性或抗性的分子途徑[21]。本研究證實,體外腫瘤類器官培養物可用于建立個體化模型以評估MEK抑制劑和抗PD-L1抗體治療的效果,說明MTS是一個可重復、簡單和廉價的模型,可以復制和預測體內臨床數據,用于在臨床前環境中測試任何免疫治療藥物的效果。MEK抑制劑和抗PD-L1抗體在全球范圍內廣泛用于惡性腫瘤的治療,本研究為今后相似的聯合實驗提供了思路和理論依據。

綜上所述,腫瘤的免疫治療需要新的組合策略來預防和克服對單一療法的耐藥性,并尋找能夠預測其敏感性的腫瘤標記物。本研究確定了抗PD-L1抗體與MEK抑制劑聯合應用的基本原理,在NSCLC的MTS模型中,雙重阻斷MEK與PD-L1具有優于單一抑制的療效。