富脂微環境通過PPARγ/ABCG2 途徑促進三陰性乳腺癌細胞的多藥耐藥

劉俊汝，郁春艷，鄭小燕，劉子璇，陳思琦，鄧為民

（天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，國家教育部免疫微環境與疾病重點實驗室，天津 300070）

乳腺癌是最常見的女性癌癥類型，也是女性癌癥死亡的最常見原因[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌的一種高度異質性亞型，預后較差[2]。由于缺乏靶向治療，以紫杉烷或鉑類為基礎的化療是三陰性乳腺癌患者的主要治療方法[3]，但致癌驅動因素的異質性和多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）的發展導致療效有限[4]。脂肪細胞是TNBC 腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中的主要細胞成分。越來越多的證據表明，腫瘤相關脂肪細胞會加重腫瘤進展，加劇免疫抑制性TME 并影響治療效果[5]。脂肪細胞產生大量的脂肪因子（包括細胞因子），參與腫瘤的發生、進展和轉移[6]。不同的脂肪因子如瘦素、脂聯素、白細胞介素－6（IL－6）和腫瘤壞死因子－α 等可通過多種功能機制誘導不同腫瘤細胞的耐藥[7]。因此，探尋富脂微環境（adipocyte－rich microenvironment，ARM）促進腫瘤耐藥的潛在機制，對提高化療療效具有重要意義。本實驗利用人脂肪組織提取液（human adipose tissue extracting solution，HATES）模擬ARM[8]，探討HATES 對TNBC 細胞MDR 的影響及機制。

MDR 是阻礙腫瘤藥物成功治療的一個嚴重問題。MDR 最突出的機制之一是ATP 結合盒（ABC）轉運蛋白的過表達[9]。ABC 轉運蛋白通過細胞膜主動泵送多種底物[10]，其中ABC 轉運蛋白G 家族成員2（ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2），又稱乳腺癌抵抗蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP），在賦予腫瘤細胞干性表型方面具有潛在作用，并且能夠外排抗腫瘤藥物，在腫瘤MDR 的發生、發展中發揮重要作用[11]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated recep tor gamma，PPARγ）屬于類固醇受體超家族的核受體，在脂肪組織的發育和脂代謝中起著重要作用[12]。PPARγ 作為重要的脂代謝調節分子，參與樹突狀細胞[13]，胎盤絨毛膜癌[14]中ABCG2 的調節。抑制PPARγ可降低ABCG2 介導的M2 巨噬細胞的外排活性[15]。此外，本實驗室前期生物信息學數據分析發現，在脂質相關腫瘤上皮性卵巢癌中，PPARγ 是促進化療耐藥的脂相關的關鍵分子。因此，本研究旨在TNBC細胞中探討HATES 是否通過PPARγ/ABCG2 途徑促進MDR。

1 材料與方法

1.1 材料 人TNBC 細胞MDA－MB－231 由天津醫科大學腫瘤醫院郭曉靜教授惠贈；胎牛血清（FBS）購自GIBCO 公司；DMEM 培養基、CCK－8 檢測試劑盒均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；紫杉醇（PTX）購自揚子江藥業集團有限公司；順鉑（DDP）購自齊魯制藥有限公司；Annexin V－PE/7－AAD 凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；熒光素酶報告基因試劑盒購自Promega 公司；PPARγ激動劑曲格列酮Trog、PPARγ 拮抗劑GW9662 均購自Selleck 公司；ABCG2 抑制劑KO143 購自MCE公司；人PPARγ 抗體購自Abcam 公司；ABCG2 抗體購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；GAPDH抗體購自CST 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 MDA－MB－231 細胞以含10%FBS 的DMEM 培養基，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，每2～3 天更換培養液并消化傳代。

1.2.2 人脂肪組織提取液HATES 制備 參考Nie等[16]的方法制備HATES，即乳腺癌患者的腫瘤鄰近脂肪組織在術后1 h 內全程無菌送至實驗室，用含1×青鏈霉素混合液的Hanks 緩沖液清洗脂肪組織并剔除筋膜及血塊，進行稱重，將脂肪組織剪切成2 mm 左右的小塊，200 目濾網研磨，按0．8 g 脂肪/mL DMEM 的標準加入適量含1×青鏈霉素混合液的DMEM，收集全部濾液，1 000 g/10 min 離心。0．22 μmol/L 的過濾器收集后分裝凍存備用。使用時應用20% FBS 1∶1 稀釋，終濃度為0．4 g 脂肪/mL。

1.2.3 CCK－8 檢測細胞增殖 將對數生長期的MDA－MB－231 細胞以7×103/孔密度接種于96 孔板，待細胞貼壁后，按分組處理細胞：（1）不同濃度的GW9662 及曲格列酮（0、5、10、20、40、60 μmol/L）及不同濃度的KO143（0、1、5、10、20、50 μmol/L）處理24 h。（2）GW9662（25 μmol/L）、曲格列酮（25 μmol/L）及KO143（10 μmol/L）處理不同時間（0、2、6、8、12、24 h）。（3）GW9662（25 μmol/L）、KO143（10 μmol/L）預處理2 h；HATES（0．4 g/mL）、DDP（30 μmol/L）、PTX（7 nmol/L）等處理48 h。每組設置3 個復孔。細胞培養結束前30 min，觀察每組細胞形態變化，并拍照記錄。按CCK－8 檢測試劑盒說明書孵育細胞，酶標儀檢測450 nm 處的吸光度值（OD450），利用GraphPad prism 9 進行統計學分析。

1.2.4 油紅O 染色檢測HATES 對MDA-MB-231細胞脂肪酸攝取的情況 將MDA-MB-231 細胞接種于24 孔板，密度為1×105/mL，細胞貼壁后處理不同濃度的HATES（0、0.2、0.4、0.8 g/mL）培養24 h。培養結束后，按照油紅O 檢測試劑盒說明書進行操作，顯微鏡下拍照分析。

1.2.5 流式Annexin V-PE/7-AAD 雙染凋亡檢測HATES、DDP、PTX 對細胞生長、增殖、凋亡的影響 將對數生長期的MDA-MB-231 細胞以2.5×105/孔密度接種于12 孔板，待細胞貼壁后，按分組處理細胞。培養結束后用0.25 %胰酶（不含EDTA）消化收集細胞，加入含2% FBS 的Hanks 洗滌2 次。棄去上清，每管加入100 μL 試劑盒中的1×Annexin V Binding Buffer 重懸細胞，實驗組先加入5 μL 的Annexin V 溶液，再加入5 μL 的7-AAD 溶液，混勻，4℃避光染色20 min。細胞通過400 目篩網過濾成單細胞懸液備檢。用流式細胞儀進行檢測，用空白管和單染管調節電壓和熒光補償，利用FlowJo 軟件進行數據分析。

1.2.6 Western 印跡檢測HATES 對該細胞PPARγ及ABCG2 蛋白表達 將對數生長期的MDA-MB-231 細胞以5×105/孔密度接種于6 孔板，待細胞貼壁后，根據實驗要求按分組處理細胞，將RIPA、蛋白酶抑制劑以1 000∶1 配置裂解液，提取細胞總蛋白。BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，配置10%的分離膠，將40 μg/孔的蛋白用10% SDS-PAGE 進行電泳分離。電泳后將蛋白轉印于PVDF 膜，100 V轉膜1 h，用3%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉2 h后，加入特異性一抗，4℃孵育過夜。加入HRP 標記的二抗室溫孵育2 h。TBST 清洗后化學發光底物檢測試劑盒進行檢測。將目的蛋白與內參的灰度比值作為蛋白的相對表達豐度。

1.2.7 小干擾RNA（siRNA）的合成和轉染 PPARsiRNA 和陰性對照-siRNA 由中國吉凱公司基因合成和構建。將對數生長期的MDA-MB-231 細胞以1×105/孔密度接種于24 孔板。待細胞貼壁后，按照Lipofectamine 3000 說明書轉染siRNA 至細胞中培養72 h。培養結束后Western 印跡驗證轉染效果。

1.2.8 熒光素酶報告基因檢測HATES、GW9662、曲格列酮對MDA-MB-231 細胞ABCG2 轉錄活性的影響 委托中國吉凱基因公司構建ABCG2-promoter-Luc 質粒及空載體GV238-Luc 質粒和β-gal質粒備用。將對數生長期的MDA-MB-231 細胞以2×105/孔密度接種于24 孔板中。待細胞貼壁后，按照Lipofectamine 3000 說明書轉染質粒至細胞中。轉染6 h 后將培基更換至含不同處理因素的常規培基進行培養48 h，其中曲格列酮濃度25 μmol/L。培養結束后，按照Promega“熒光素酶報告基因試劑盒”說明書裂解細胞，避光加入100 μL 熒光素酶底物，用Promega 熒光素酶標儀檢測ABCG2-promoter Luciferase 的活性。同時吸取20 μL 裂解上清，避光加入80 μL ONPG，37℃孵育30 min 后，檢測β-gal活性。Luciferase 的相對活性為Luciferase 的活性與β-gal 活性的比值，GraphPad prism 9 統計并作圖。

1.2.9 統計學處理 采用GraphPad prism 9 軟件進行統計學分析和作圖。正態分布的計量資料使用±s 表示，多組間相互比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PPARγ 拮抗劑GW9662 及激動劑曲格列酮與ABCG2 抑制劑KO143 對MDA-MB-231 細胞的劑量和時間效應 本研究側重探討ARM 對腫瘤細胞的效應，首先確定GW9662、曲格列酮及KO143 等試劑的最適濃度和時間，CCK-8 實驗結果顯示，GW9662、曲格列酮及KO143 對細胞作用24 h 的IC50 分別為26.91、26.57、13.57 μmol/L。根據IC50結果選取25 μmol/L GW9662、25 μmol/L 曲格列酮與10 μmol/L KO143 進行時間效應實驗。如圖1B結果顯示25 μmol/L GW9662、25 μmol/L 曲格列酮與10 μmol/L KO143 處理2 h 均不影響細胞增殖（均P＞0.05）。結合預期結果，選取25 μmol/L GW9662、25 μmol/L 曲格列酮與10 μmol/L ABCG2 預處理細胞2 h，在不影響細胞增殖的情況下進行后續實驗（圖1）。

圖1 GW9662、曲格列酮與KO143 對MDA-MB-231 細胞增殖的劑量和時間效應Fig 1 Dose and time effects of GW9662，Trog and KO143 on the proliferation of MDA-MB-231 cells

2.2 HATES 促進MDA-MB-231 細胞脂滴的積累如圖2 結果顯示，0.4 g/mL HATES 和0.8 g/mL HATES 均顯著促進細胞脂滴的積累，但與對照組相比0.8 g/mL HATES 處理組，細胞形態明顯改變，皺縮變圓。結合細胞狀態最終選擇0.4 g/mL HATES進行后續實驗。

圖2 HATES 促進MDA-MB-231 細胞脂滴的積累Fig 2 The accumulation of lipid droplets in MDA-MB-231 cells promoted by HATES

2.3 HATES 促進MDA-MB-231 細胞MDR 結果顯示，與對照組相比，HATES 濃度未影響細胞生長、增殖及凋亡（均P＞0.05，圖3A、3B、3C）。如圖3B CCK-8 結果顯示，與對照組相比，DDP 組和PTX 組細胞增殖顯著降低（t=7.95、16.11，均P＜0.000 1）。與單獨DDP 相比，DDP+HATES 組細胞增殖明顯增強（t=3.76，P＜0.05）；PTX+HATES 組與之類似（t=8.54，P＜0.01）。如圖3C、3D 流式凋亡檢測結果顯示，與對照組相比，DDP 和PTX 組大量細胞凋亡（t=33.62、34.90，均P＜0.000 1）；與單獨DDP 組相比，DDP+HATES 組細胞凋亡顯著降低（t=19.68，P＜0.000 1）；PTX+HATES 組與之類似（t=29.24，P＜0.000 1）。細胞的增殖和凋亡與形態圖趨勢一致。

圖3 HATES 促進MDA-MB-231 細胞MDRFig 3 MDA-MB-231 cell MDR promoted by HATES

2.4 HATES 通過調節PPARγ 上調ABCG2 表達 本課題組前期生物信息學分析數據表明，PPARγ 是促進化療耐藥的脂相關的關鍵分子，ABCG2 是其下游重要靶基因之一。為了確定HATES 是否通過PPARγ 促進ABCG2 的轉錄，進行熒光素酶報告基因檢測（圖4A、4B）。結果顯示，與空載體組相比，PPARγ 拮抗劑GW9662 顯著降低ABCG2 的轉錄活性（t=18.45，P＜0.000 1），曲格列酮可顯著提高ABCG2 的轉錄活性（t=29.01，P＜0.000 1）。HATES 組ABCG2 的轉錄活性顯著增強（t=4.69，P＜0.01）。與HATES 組相比，HATES+GW9662 組ABCG2 的轉錄活性顯著降低（t=5.39，P＜0.001），HATES+曲格列酮組ABCG2 的轉錄活性顯著增強（t=8.18，P＜0.000 1）。此外，Western 印跡結果顯示HATES 處理促進細胞PPARγ 和ABCG2 蛋白表達，而GW9662 降低了HATES 的促進作用（圖4C、4D）。

圖4 HATES 通過調節PPARγ 上調ABCG2 表達Fig 4 HATES upregulated ABCG2 expression by regulating PPARγ

2.5 HATES 通過PPARγ/ABCG2 途徑內源性促進MDA-MB-231 細胞MDR 如圖5A Western 印跡結果顯示，沉默PPARγ 不僅降低了ABCG2 的蛋白表達，還減弱了由HATES 引起的PPARγ 和ABCG2 蛋白表達的增強效應。如圖5B、5C 結果顯示，應用DDP和PTX 時，HATES 促進細胞的增殖，而沉默PPARγ可抑制該效應（t=9.14，P＜0.01；t=12.84，P＜0.001）。同樣，如圖5D 流式凋亡檢測結果所示，應用DDP 和PTX 時，HATES 抑制細胞的凋亡，沉默PPARγ 減弱了此影響（t=4.763、16.25，均P＜0.000 1）。

圖5 HATES 通過PPARγ/ABCG2 途徑內源性促進MDA-MB-231 細胞MDRFig 5 HATES promoted MDA-MB-231 cell MDR via PPARγ/ABCG2 pathway endogenously

2.6 HATES 通過PPARγ/ABCG2 途徑外源性促進MDA-MB-231 細胞MDR 如圖6A、6B 結果所示，與DDP+HATES 組相比，DDP+HATES+GW9662 組與DDP+HATES+KO143 組的細胞增殖顯著下降（t=3.02、3.41，均P＜0.05）；與PTX+HATES 組相比，PTX+HATES+GW9662 組與PTX+HATES+KO143 組的細胞增殖顯著下降（t=4.93、4.59，均P＜0.001）。如圖6C顯示，與DDP+HATES 組相比，DDP+HATES+GW9662組與DDP+HATES+KO143 組細胞凋亡率顯著增高（t=9.06、14.14，均P＜0.000 1）；與PTX+HATES 組相比，PTX+HATES+GW9662 組與PTX+HATES+KO143 組細胞凋亡率顯著增高（t=13.72、12.20，均P＜0.000 1）。

3 討論

TNBC 占所有乳腺癌病例的10%～15%，是最致命的乳腺癌亞型[17]。TNBC 缺乏雌激素（ER）和孕激素受體（PR），表達低水平的人表皮生長因子受體2（HER2），因此對激素或抗HER2 治療無反應[18]。因其具有高異質性，侵襲性和缺乏治療選擇，化療仍然是TNBC 的標準療法，但患者經常產生耐藥性[19]。脂肪細胞在構成乳腺組織的細胞中占最大比例，被認為是乳腺癌腫瘤微環境中的關鍵細胞類型[20]。脂肪細胞來源的條件培養基有助于乳腺癌、胰腺導管癌和人類黑色素瘤對化療和靶向治療的抵抗[21]。因此迫切需要探究ARM 對TNBC 化療耐藥的影響，以確定新的靶點來減弱或逆轉化療耐藥。本研究通過HATES 模擬ARM，發現其在化療藥物存在情況下促進TNBC 細胞增殖并減少細胞凋亡，證實HATES促進TNBC 細胞的MDR。

腫瘤細胞中的MDR 與許多機制有關，包括DNA修復和損傷，藥物代謝改變，抑制細胞凋亡和外排轉運蛋白的過表達等[22]。ABCG2 可有效的將廣譜化療藥物排出腫瘤細胞，引起臨床MDR[23]。因此，發現有效的調節劑以規避ABCG2 介導腫瘤的MDR 非常重要。PPARγ 主要在脂肪組織、造血細胞和大腸中表達[12]。脂肪酸是PPARγ 的天然激動劑。一項關于人腦樹突狀細胞研究顯示PPARγ 是ABCG2 新的調節劑[13]。此外，在胎盤滋養層細胞中使用PPARγ激動劑顯著促進了ABCG2 的表達[14]。本研究熒光素酶報告基因結果表示HATES 通過PPARγ 提高ABCG2 的轉錄活性。

在各種富含脂肪細胞的相關腫瘤中，脂肪細胞在腫瘤進展中起著至關重要的作用。脂肪細胞-卵巢癌細胞共培養導致脂質從脂肪細胞直接轉移到卵巢癌細胞，并促進體外和體內腫瘤細胞生長[24]。同時脂肪細胞通過脂肪酸轉運蛋白（FATPs）推動黑色素瘤的進展[25]。本實驗主要關注HATES 通過PPARγ/ABCG2 影響TNBC 細胞耐藥，因此實驗中HATES 調整為不影響腫瘤細胞增殖、凋亡的濃度，以排除其影響耐藥造成的干擾。在膀胱癌中，GW9662 及曲格列酮處理48~96 h 均對細胞增殖有影響[26]，本實驗通過探索GW9662、曲格列酮及KO143 的使用濃度及處理時間，結合細胞活性及狀態選擇GW9662、曲格列酮及KO143 預處理細胞2 h[27-28]，在藥物本身不改變腫瘤細胞增殖和凋亡以避免干擾的情況下，探討HATES 是否通過PPARγ/ABCG2 途徑參與MDR。在乳腺癌中，腫瘤細胞自分泌產生的脂肪因子IL-6 可以上調ABCG2的表達，從而促進MDR 水平[7]。在本實驗中，HATES通過PPARγ/ABCG2 途徑促進TNBC 細胞的MDR，但由于HATES 成分復雜，且本研究中獲取HATES需進行研磨和過濾等操作，會損失一部分發揮作用的效應因子，因此后續將應用脂質組學分析檢測HATES 中起主要作用的脂質代謝物，以及細胞因子芯片分析HATES 中發揮主要作用的脂肪因子。

綜上所述，本研究通過體外實驗證實HATES 通過PPARγ/ABCG2 途徑促進TNBC 細胞的MDR，對臨床干預TNBC 提供潛在的治療靶點具有指導意義。