基于生物信息學及分子對接研究天牛止眩膠囊治療原發性高血壓的潛在活性成分及分子機制

蔡子杰 姚昆鵬 蔡虎志 陳新宇

[摘要]?目的?利用生物信息學及分子對接，探討天牛止眩膠囊治療原發性高血壓（essential?hypertension，EH）的潛在活性成分及分子機制。方法?利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺、BATMAN-TCM平臺篩選天牛止眩膠囊的活性成分及藥物靶點，使用GeneCards、PharmGkb、TTD、DrugBank檢索EH的疾病相關靶點，采用Cytoscape3.8.0軟件構建“藥物–成分–靶點”網絡圖，應用STRING平臺進行蛋白質–蛋白質相互作用分析，使用R軟件包進行基因本體論（gene?ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）富集分析，運用AutoDockTools及AutoDock?Vina進行分子對接驗證，使用PyMol軟件進行可視化分析。結果?共篩選出天牛止眩膠囊有效成分53種，涉及相關靶點基因422個。篩選出關鍵活性化合物217個，拓撲分析得出核心靶點蛋白AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、MAPK1、JUN等10個，GO及KEGG富集分析結果提示天牛止眩膠囊干預EH主要涉及細胞對外的刺激、對活性氧的反應、氧化應激反應等多種生物學途徑與涉及脂質和動脈粥樣硬化、流體剪切應力和動脈粥樣硬化等相關通路。分子對接結果顯示FOS與槲皮素及山柰酚結合力最強。結論?天牛止眩膠囊中的槲皮素、山柰酚等多種關鍵活性成分可作用于FOS、JUN、AKT等多個核心靶點蛋白，發揮調控血壓、降低心腦血管并發癥危險等級、保護靶器官的作用。

[關鍵詞]?天牛止眩膠囊；原發性高血壓；生物信息學；分子對接；分子機制

[中圖分類號]?R255.3；R256.2??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.009

The?potential?active?ingredients?and?molecular?mechanism?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?in?treatment?of?essential?hypertension?based?on?bioinformatics?and?molecular?docking

CAI?Zijie1，?YAO?Kunpeng1，?CAI?Huzhi2，?CHEN?Xinyu1，2

1.Graduate?School?of?Hunan?University?of?Chinese?Medicine，?Changsha?410208，?Hunan，?China;?2.Department?of?Cardiovascular?Medicine，?the?First?Hospital?of?Hunan?University?of?Chinese?Medicine，?Changsha?410007，?Hunan，?China

[Abstract]?Objective?The?potential?active?ingredients?and?molecular?mechanism?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?in?treating?essential?hypertension?（EH）?were?studied?based?on?bioinformatics?and?molecular?docking.?Methods?Traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform?and?BATMAN-TCM?datebase?were?used?to?screen?active?ingredients?and?drug?targets?of?Tianniu?Zhixuan?capsule.?GeneCards，?PharmGkb，?TTD?and?DrugBank?were?used?to?search?disease-related?targets?of?EH.?The?“drug-composition-target”?network?map?was?constructed?using?Cytoscape3.8.0?software.?STRING?platform?was?used?for?protein-protein?interaction?analysis，?R?software?package?was?used?for?gene?ontology?（GO）?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?（KEGG）?enrichment?analysis，?AutoDockTools?and?AutoDock?Vina?were?used?for?molecular?docking?verification，?PyMol?software?was?used?for?visual?analysis.?Results?A?total?of?53?effective?ingredients?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?were?screened，?involving?422?related?target?genes.?A?total?of?217?key?active?compounds?were?screened，?and?10?core?target?proteins?were?identified?by?topological?analysis，?including?AKT1，?MAPK8，?NFKB1，?FOS，?MAPK1，?JUN，?etc.?GO?and?KEGG?enrichment?analysis?indicated?that?the?intervention?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?in?EH?mainly?involved?various?biological?pathways?such?as?external?cell?stimulation，?response?to?activated?oxygen，?oxidative?stress?and?other?biological?pathways，?as?well?as?lipid?and?atherosclerosis，?fluid?shear?stress?and?atherosclerosis?and?other?related?pathways.?Molecular?docking?results?showed?that?FOS?had?the?strongest?binding?force?with?quercetin?and?kaempferol.?Conclusion?Quercetin，?kaempferol?and?other?key?active?ingredients?in?Tianniu?Zhixuan?capsule?can?act?on?FOS，?JUN，?AKT?and?other?core?target?proteins，?and?play?a?role?in?regulating?blood?pressure，?reducing?the?risk?level?of?cardiovascular?and?cerebrovascular?complications?and?protecting?target?organs.

[Key?words]?Tianniu?Zhixuan?capsule;?Essential?hypertension;?Bioinformatics;?Molecular?docking;?Molecular?mechanism

當前，高血壓仍是全球疾病負擔較重的疾病之一，也是我國面臨的重要公共衛生問題之一[1-2]。由于經濟及社會醫療資源分配的不均衡，中國高血壓人群的血壓控制不甚理想。中醫藥對控制血壓、保護靶器官、提高患者遠期生存率、延緩心腦血管疾病進展具有重要意義[3]。湖南中醫藥大學第一附屬醫院自制天牛止眩膠囊（原名血壓平膠囊）用于治療原發性高血壓（essential?hypertension，EH），可降低血壓，逆轉血管重塑，保護靶器官，改善心室重構和胰島素抵抗，延緩左心室肥厚[4-6]。本文旨在利用生物信息學技術及分子對接方法，探討天牛止眩膠囊治療EH的作用機制，為后續課題組的進一步驗證提供思路。

1??材料與方法

1.1??有效成分篩選及作用靶標預測

天牛止眩膠囊由漢防己、牛膝、菊花、酸棗仁、天麻組成。在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform，TCMSP）檢索漢防己、牛膝、菊花、酸棗仁的有效成分及相應靶點，篩選條件：生物利用度≥30%和類藥性≥0.18；在BATMAN-TCM平臺檢索天麻的有效成分及相應靶點，篩選條件：校正P<0.05及分數截斷值≥30。使用UniProt數據庫標準化天牛止眩膠囊有效成分靶點。

1.2??疾病靶點的收集

使用“essential?hypertension”作為關鍵詞，檢索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數據庫，獲得EH的疾病靶點基因。篩選并合并上述基因庫中與EH相關基因，剔除重復基因。

1.3??藥物-疾病核心作用基因篩選

將天牛止眩膠囊的藥物靶點基因與EH疾病靶點基因映射，并繪制韋恩圖。借助Cytoscape3.8.0軟件，導入藥物靶點–疾病靶點映射交集文件，構建“藥物–成分–靶點”圖。

1.4??靶蛋白相互作用網絡構建與拓撲分析

將獲得的交集靶基因導入STRING平臺，設置物種為人類，最低互動得分≥0.9，獲得蛋白質–蛋白質相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網絡圖，并刪除游離節點。運用Cytoscape3.8.0軟件進行可視化分析，使用CytoNCA插件進行拓撲分析，計算各節點度值，獲取核心靶點基因。

1.5??富集分析

利用R軟件包對交集基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）通路與基因本體論（gene?ontology，GO）富集分析。

1.6??分子對接

選擇藥物–成分–靶點中排名前2的活性化合物作為小分子配體，在PubChem?CID數據庫獲取有效成分的化學結構，于Uniprot數據庫中查詢關鍵靶點信息，在PDB數據庫下載核心靶點蛋白結構，利用PyMOL軟件移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子。使用AutoDockTools1.5.7軟件將晶體結構加氫、加電荷。使用AutoDock?Vina軟件進行分子對接，計算最低結合能，使用PyMol軟件處理和可視化分子對接結果。

2??結果

2.1??活性成分篩選及作用靶標預測

于TCMSP數據庫檢索得到40種化合物。其中防己3種、牛膝20種、菊花8種、酸棗仁9種。使用BATMAN-TCM平臺進行補充，得到天麻相關化合物13種。使用Uniprot數據庫標準化轉換活性成分及對應靶點，通過匹配并篩選去除重復值，獲得422個靶點。

2.2??疾病靶點的收集及藥物靶點與疾病靶點交集

檢索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數據庫，分別得到EH靶點2781、57、72、112、76個，篩選并去除重復值后得到靶點2872個，見圖1。藥物靶點與疾病靶點有217個交集，見圖2。

2.3??篩選藥物-疾病核心作用基因

將天牛止眩膠囊的預測靶點與EH的相關靶點取交集，再導入Cytoscape軟件，構建“藥物–成分–靶點”網絡圖，見圖3。圖中共計256個節點，467條邊。天牛止眩膠囊中有效成分槲皮素、山柰酚、棕櫚酸、漢黃芩素、β-谷甾醇分別與101、39、33、31、24個靶點相關。PTSG1（18個）是有效成分對應靶點數量最多的基因，其次是PTGS2（17個）、AR（16個）和PGR（16個）。

2.4??PPI網絡構建與拓撲分析

將篩選的天牛止眩膠囊與EH的217個共同靶點提交至STRING平臺，構建天牛止眩膠囊干預EH的PPI網絡，見圖4。該PPI網絡圖中有162個節點，633條邊。使用CytoNCA功能進行拓撲分析，對基因相關指標進行篩選，得到13個核心基因。網絡拓撲分析顯示，核心基因前10位分別為TNF、EGFR、AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、TP53、ESR1、MAPK1、JUN，見圖5。

注：右側黃色代表作用靶點，左側圓圈代表藥物有效成分，淡紫色代表天麻有效成分，淡紅色代表酸棗仁有效成分，天藍色代表牛膝有效成分，墨藍色代表防己有效成分，深紫色代表菊花有效成分，淡粉色代表防己與牛膝共有有效成分，淡綠色代表菊花與牛膝共有有效成分，深綠色代表天麻與菊花有效成分

2.5??富集分析

將天牛止眩膠囊的217個潛在靶點進行基因富集分析，得到2778個GO富集條目，包括生物過程2440個、細胞組分103種和分子功能235種，得到195條KEGG通路。各選取生物過程、細胞組分、分子功能排名前10的GO條目繪制柱狀圖，選取KEGG通路前30的條目繪制氣泡圖，見圖6。

A.FOS與槲皮素結合模式圖；B.FOS與山柰酚結合模式圖；C.JUN與槲皮素結合模式圖；D.JUN與山柰酚結合模式圖；E.AKT與槲皮素結合模式圖；F.AKT與山柰酚結合模式圖

2.6??分子對接

選取“藥物–成分–靶點”網絡中與靶點互動關系密切程度居前的2個活性化合物（槲皮素、山柰酚）作為小分子配體。篩選2次拓撲分析后獲得的前10核心靶點蛋白，選擇與活性成分有關聯的靶點蛋白（AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、MAPK1、JUN），使用AutoDock?Vina軟件進行分子對接，并計算各個蛋白與小分子配體間的最低結合能，見表1。利用PyMol軟件數據庫可視化分析對接效果最好的6對分子–靶點模式圖，見圖7。

3??討論

根據高血壓病的發病癥狀，中醫將EH歸為眩暈、頭痛等范疇[7]。歷代醫家多認為“諸風掉眩，皆屬于肝”，從肝風、肝陽角度論治高血壓病成為主流。其病機為肝陽上亢、痰飲內停、腎陰虧虛，常夾雜發病。多治以平肝潛陽、化痰息風、健脾祛濕、滋補肝腎、養陰填精法[3]。高血壓病責之在肝，其次為心、腎。肝體陰而用陽，賴陰血以滋養，故肝陰不足，陽則易亢。另肝主疏泄，司條達，疏泄失常，致肝郁氣滯、郁而化熱、耗傷陰血，可致肝陰虧虛、肝陽上亢或肝火熾盛。肝藏血，心主血，肝陰血不足，可致心火亢盛，心火亢盛可耗傷肝陰。腎藏精，肝陰虧損，下竭腎陰，水不涵木，肝陽亢盛。天牛止眩膠囊重在治肝，兼顧心、腎，共奏養肝柔肝、平肝潛陽、利尿定眩之效。

前期研究發現，天牛止眩膠囊可通過下調心肌組織Toll樣受體（Toll-like?receptor，TLR）2、TLR4、MyD88蛋白的表達，從而抑制核因子κB（nuclear?factor-κB，NF-κB）活化，達到降血壓、改善高血壓所致的靶器官損傷、心室重構等作用[6]。天牛止眩膠囊可改善EH患者的胰島素抵抗，減少EH患者的危險因素，降低其危險分層[4-5]?，F代藥理研究顯示，天麻素通過一氧化氮（nitric?oxide，NO）/可溶性鳥苷酸環化酶（soluble?guanylate?cyclase，sGC）/環磷酸鳥苷（cyclic?guanosine?monophosphate，cGMP）介導的途徑參與內皮依賴性舒張[8]。酸棗仁皂苷通過內皮細胞通道增加Ca2+內流誘導內皮型一氧化氮合酶（endothelial?nitric?oxide?synthase，eNOS）激活，并通過打開內皮細胞BKCa和KATP通道誘導超極化降低血管張力、保護內皮功能[9]。菊花的主要提取物黃酮類化合物可調節腸道菌群，抑制腸源性脂多糖/TLR4通路的激活，改善血管內皮功能，起到降壓作用[10]。漢防己中所含的粉防己堿可通過抑制HepG2細胞的細胞毒性、活性氧生成和谷胱甘肽耗竭，有效緩解氧化損傷，改善氧化應激[11]。懷牛膝可通過調節表皮生長因子受體和胞外信號調節激酶激活eNOS，增加NO的產生，舒張血管[12]。另外，懷牛膝可下調巨噬細胞中的NF-κB和活化蛋白-1（activating?protein-1，AP-1）抑制誘導型一氧化氮合酶（inducible?nitric?oxide?synthase，iNOS）、環氧合酶2、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β表達，發揮抗炎作用[13]。

筆者采用生物信息學技術及分子對接方法，對天牛止眩膠囊治療EH進行分子機制方面的探討。初步篩選出天牛止眩膠囊調控EH的主要活性成分為槲皮素、山柰酚。動物研究發現槲皮素可減輕氧化應激反應，舒張血管平滑肌，改善血管內皮功能障礙，起到調節血壓的作用[14]。其機制可能與槲皮素可顯著抑制NO、iNOS、IL-6、NF-κB的核易位、細胞外信號調節激酶1/2和c-Jun?N末端激酶的產生有關[15]。槲皮素還可抑制炎癥介質的產生[16]。研究證實山柰酚有利尿和腎臟保護作用；山柰酚可通過NO/cGMP/cGMP依賴性蛋白激酶途徑誘導內皮依賴性血管松弛[17]。分子對接結果證實，槲皮素、山柰酚等活性成分能以疏水鍵、氫鍵與核心靶點進行對接結合，且結合強度較高。

天牛止眩膠囊調控EH的主要靶點與炎癥應答、氧化應激、內皮功能障礙、細胞凋亡、血管重塑等有關，涉及脂質和動脈粥樣硬化、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、缺氧誘導因子-1信號通路、細胞凋亡、松弛素等多條信號通路。研究表明，上述通路廣泛參與高血壓的氧化應激、炎癥反應、免疫介導和血管內皮功能障礙，并與內皮損傷介導的動脈粥樣硬化、高血壓導致的心室重構及心肌纖維化有關[18-21]。

本研究借助網絡藥理學方法，分析天牛止眩膠囊調控EH的機制。結果表明天牛止眩膠囊體現多通路、多靶點聯合作用調控血壓的特點，分子對接方法驗證結果符合預期。

[參考文獻][1] POULTER?N?R，?PRABHAKARAN?D，?CAULFIELD?M.?Hypertension[J].?Lancet，?2015，?386（9995）：?801–812.

[11] WANG?L，?CI?X，?LV?H，?et?al.?Isotetrandrine?ameliorates?tert-butyl?hydroperoxide-induced?oxidative?stress?through?upregulation?of?heme?oxygenase-1?expression[J].?Exp?Biol?Med?（Maywood），?2016，?241（14）：?1568–1576.