西藏4種杜鵑屬植物內生真菌群落組成及多樣性分析

王素娟　常子惠　張永娟　衛波寧　德吉

摘要［目的］挖掘西藏杜鵑花科杜鵑屬植物內生真菌資源，研究米林杜鵑（Rhododendron mainlingense）、髯花杜鵑（R.anthopogon）、雪層杜鵑（R.nivale）和雪山杜鵑（R.aganniphum）內生真菌的群落組成及多樣性。［方法］采用組織分離法對上述4種杜鵑的根、莖、葉和花內生真菌進行分離，用ITS分子標記方法進行菌株鑒定。［結果］西藏4種杜鵑屬植物720個組織塊中分離得到336株內生真菌，這些真菌被鑒定為2門5綱10目16科21屬55種。4種杜鵑屬植物內生真菌多樣性指數無顯著差異。雪山杜鵑（H′=1.96，D=0.80）和雪層杜鵑（H′=1.81，D=0.77）內生真菌Shannon多樣性指數（H′）和辛普森指數（D）高于髯花杜鵑（H′=1.36，D=0.71）和米林杜鵑（H′=1.17，D=0.65）內生真菌多樣性。根、莖、葉、花不同部位內生真菌多樣性也無顯著差異。不同部位的H′和D指數分別為根部H′=2.63、D=0.86，莖H′=2.35、D=0.83，葉H′=2.26、D=0.80，花H′=2.23、D=0.83。［結論］研究結果為挖掘杜鵑中內生真菌資源和藥效物質篩選研究提供了基礎數據。

關鍵詞杜鵑；內生真菌；群落組成；多樣性

中圖分類號Q948.1文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）11-0138-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.034開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Analysis on the Community Composition and Diversity of Endophytic Fungi in Four Species of Rhododendron in Tibet

WANG Su-juan CHANG Zi-hui ZHANG Yong-juan et al（1.School of Science，Tibet University，Lhasa，Tibet 850000;2.Agriculture Research Institute， Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Lhasa，Tibet 850000）

Abstract［Objective］To explore the endophytic fungal resources of Rhododendron genus in the Rhododendron family in Tibet， and to study the community composition and diversity of endophytic fungi in Rhododendron mainlingense， R. anthopogon， R. nivale and R. aganniphum.［Method］The endophytic fungi from roots， stems， leaves and flowers of four species were isolated using tissue isolation method and identified by ITS sequencing.［Result］A total of 336 endophytic fungi were isolated from 720 tissues blocks of 4 species of Rhododendron plants in Tibet. These fungi were identified as 55 species belonging to 2 phyla， 5 classes， 10 orders， 16 families， 21 genera and 55 species.There was no significant difference in the diversity index of endophytic fungi among the four Rhododendron species.The diversity shannon index （H′） and simpson index（D） of endophytic fungi in R. aganniphum （H′=1.96，D=0.80） and R.nivale （H′=1.81， D=0.77） were higher than in R.anthopogon （H′=1.36， D=0.71） and R. mainlingense （H′=1.17，D=0.65）. There was no significant difference in the diversity of endophytic fungi in different parts of roots， stems， leaves and flowers.The H′ index and D index in different tissues as follows：H′=2.63， D=0.86 in roots， H′=2.35，D=0.83 in stems， H′=2.26，D=0.80 in leaves and H′=2.23，D=0.83 in flowers. ［Conclusion］The research results provide basic data for the exploration of endophytic fungal resources and screening of pharmacological substances in Rhododendron.

Key wordsRhododendron;Endophytic fungi;Community composition;Diversity

杜鵑屬（Rhododendron L.）是杜鵑花科（Ericaceae）植物，其中米林杜鵑（Rhododendron mainlingense）、髯花杜鵑（R.anthopogon）、雪層杜鵑（R.nivale）和雪山杜鵑（R.aganniphum）主要分布于海拔2 700～5 800 m的高山地區［1］。據文獻記載［2-4］，杜鵑根、莖、葉、花和果均可入藥，根部具有祛風止痛、消腫散瘀、止咳等功效，可用于治療跌打損傷、風寒濕痹、癬瘡；葉具有解毒、清熱和止血的功效；花具有除濕祛風、化瘀止痛的療效；果實具有祛風鎮痛、平喘止咳、化瘀消腫等功效。杜鵑可用于治療炎癥相關的疾病，如支氣管炎、風濕病、關節炎等。

藥用植物內生真菌是植物微生態系統中的重要組成部分，植物內生真菌是生活在植物細胞中或在其生活史某一時期生活在植物組織內，不引起植物發生明顯病變的一類真菌［5-8］。有的內生真菌與植物生長密切相關，影響著植物種子的萌發，可促進植物生長和競爭力。有的內生真菌具有合成宿主次生代謝產物的能力［9-12］，同時植物真菌群落與寄主之間的相互作用是植物適應環境的重要因素［13-14］。自短葉紅豆杉內生真菌中得到紫杉醇［15］以來，挖掘、篩選其他植物內生真菌藥效物質已成為重要的研究方向。已有報道西藏米拉山雪層杜鵑中分離得到了4屬內生真菌，分別為曲霉屬（Aspergillus）、擬隱殼孢屬（Cryptosporiopsis）、鐮刀菌屬（Fusarium）、殼多胞菌屬（Stagonospora）［16］。但是，杜鵑種間內生真菌的差異和不同部位的內生真菌差異目前鮮見報道。該研究通過ITS分子標記方法對采集于西藏地區的4種杜鵑屬植物的內生真菌進行鑒定與分析，比較不同種杜鵑之間內生真菌多樣性，為挖掘杜鵑植物內生真菌資源以及篩選藥效物質提供前期數據。

1材料與方法

1.1杜鵑花屬植物內生真菌的樣品采集于2021年6—8月在西藏不同地區采集杜鵑屬全株新鮮植物，采樣信息見表1。每個采樣點選取新鮮健康植株6株，樣品采集后放置于4 ℃冰箱，待處理。

1.2杜鵑屬植物內生真菌的分離純化及保存將采集的新鮮杜鵑植物的根、莖、葉、花用無菌水沖洗干凈。用已滅菌的解剖刀將根、莖、葉和花所需部分切成小塊，其中根部組織192塊、葉部組織192塊、莖部組織192塊、花部組織144塊。在無菌條件下將切好的植物材料置于75%乙醇浸泡2 min后，用無菌水沖洗3次，再用1%次氯酸鈉溶液浸泡3 min后，無菌水沖洗3次，然后將植物橫截面貼入PDA培養皿（已加Amp和Kan抗生素）中培養3～7 d。每隔1 d觀察，將植物組織塊周圍長出的不同菌落分離，接種到新的PDA 固體培養基中，分離純化3次，得到純化的菌落。用組織塊印跡法和無菌水檢測法作為對照，來檢驗植株表面消毒情況。

1.3杜鵑屬植物內生真菌的鑒定通過改良的CTAB法［17］提取杜鵑屬植物內生真菌的DNA。用通用引物ITS1（5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行擴增。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，52 ℃復性45 s，72 ℃延伸90 s，重復35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃低溫保存。將PCR反應得到的產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（成都）股份有限公司進行測序，測序后獲得的ITS序列在NCBI中用BLAST 進行同源性序列比對，以此進行內生真菌的鑒定。

1.4內生真菌群落多樣性分析通過Shannon多樣性指數（Shannon-Weiner diversity index，H′）、辛普森指數（Simpson，D）、均勻度指數（evenness，E）、定殖率（colonization rate，CR）、分離率（isolation rate，IR）和分離頻率（isolation frequency，IF）［18-23］分析杜鵑內生真菌的群落組成和多樣性。該研究分別采用R語言、Origin 2021和Excel軟件對杜鵑屬植物內生真菌進行分析和繪圖。

2結果與分析

2.1杜鵑花屬植物內生真菌種類杜鵑屬植物720個組織塊中分離得到336株內生真菌，經過分子生物學鑒定，將336株內生真菌鑒定為子囊菌門、毛霉菌門2門，毛霉菌綱、座囊菌綱、糞殼菌綱、散囊菌綱、錘舌菌綱5綱，10目16科21屬55種（表2）。

2.2杜鵑花屬植物不同組織內生真菌的群落組成從圖1可以看出，4種杜鵑屬植物根部組織192塊中分離出93株內生真菌，隸屬于13屬，其優勢屬為曲霉屬Aspergillus（40.86%）、白僵菌屬Beauveria（19.35%）和青霉屬Penicillium（16.13%）。莖部組織192塊中分離出94株內生真菌，其優勢屬為曲霉屬（37.23%）、白僵菌屬（25.53%）和青霉屬（25.53%）。葉部組織192塊分離出80株內生真菌，其優勢屬為白僵菌屬（38.75%）、青霉屬（28.75%）和曲霉屬（21.25%）?；ńM織144塊中分離出69株內生真菌，優勢屬為曲霉屬（33.33%）、白僵菌屬（30.43%）和青霉屬（23.19%）。

研究結果還發現根部組織特有屬為錐毛殼屬Coniochaeta（2.15%）、彎胞屬Curvularia（1.08%）、炭球菌屬Daldinia（4.30%）、脈孢菌屬Neurospora（1.08%）、鱗翅蟲草屬Samsoniella（1.08%）、籃狀菌屬Talaromyces（3.21%）和殼囊孢屬Cytospora（2.15%）。莖組織特有屬為略氏端隔孢殼菌屬Apiospora（1.06%）和假散囊菌屬Pseudeurotium（1.06%）。葉組織特有屬為枝孢霉屬Cladosporium（1.25%）、亞隔孢殼屬Didymella（1.25%）和綠僵菌屬Metarhizium（2.50%）?；ńM織特有屬為毛殼屬Chaetomium（1.45%）。

4種杜鵑屬植物根、莖、葉、花組織內生真菌優勢種都是曲霉屬、白僵菌屬和青霉屬（圖2）。米林杜鵑中分離出41株內生真菌，分為4屬，分別為鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉屬、白僵菌屬和青霉屬；髯花杜鵑分離出67株內生真菌，分為5屬，分別為鏈格孢屬、曲霉屬、白僵菌屬、青霉屬和籃狀菌屬；雪層杜鵑分離出119株內生真菌，分為10屬，分別為放射毛霉屬（Actinomucor）、鏈格孢屬、曲霉屬、白僵菌屬、青霉屬、附球菌屬（Epicoccum）、綠僵菌屬、毛霉屬（Mucor）、鱗翅蟲草屬和木霉屬（Trichoderma）；雪山杜鵑分離出99株內生真菌，分為17屬，分別為鏈格孢屬、略氏端隔孢殼菌屬、曲霉屬、白僵菌屬、枝孢霉屬、錐毛殼屬、彎胞屬、毛殼屬、殼囊孢屬、炭球菌屬、亞隔孢殼屬、青霉屬、脈孢菌屬、假散囊菌屬、附球菌屬、毛霉屬和木霉屬。

4種杜鵑屬植物根、莖、葉、花組織內生真菌的特有屬共有12屬，分別是枝孢霉屬 、錐毛殼屬、彎胞屬、炭球菌屬、亞隔孢殼屬、綠僵菌屬、脈孢菌屬、假散囊菌屬、鱗翅蟲草屬、籃狀菌屬、毛殼屬和殼囊孢屬。在根部組織中，鏈格孢屬和籃狀菌屬為髯花杜鵑的特有屬，錐毛殼屬、彎胞屬、炭球菌屬、附球菌屬、脈孢菌屬和殼囊孢屬為雪山杜鵑的特有屬，鱗翅蟲草屬為雪層杜鵑特有屬；在莖部組織中，放射毛霉屬為雪層杜鵑特有屬，鏈格孢屬、略氏端隔孢殼菌屬、毛霉屬和假散囊菌屬為雪山杜鵑的特有屬；在葉部組織中，放射毛霉屬、鏈格孢屬、略氏端隔孢殼菌屬、綠僵菌屬和木霉屬為雪層杜鵑特有屬，枝孢霉屬、亞隔孢殼屬為雪山杜鵑的特有屬；在花組織中，毛霉屬為雪層杜鵑特有屬，毛殼屬為雪山杜鵑的特有屬。

從表3可以看出，杜鵑屬植物不同組織部位的定殖率分別為莖92.71%、根91.15%、花90.97%、葉90.63%，分離率分別為莖48.96%、根48.44%、花47.92%、葉41.67%。

2.3杜鵑屬植物內生真菌的多樣性分析4種杜鵑屬植物多樣性分析結果（表4）顯示，Shannon多樣性指數（H′）從大到小依次為雪山杜鵑>雪層杜鵑>髯花杜鵑>米林杜鵑，多樣性最高的是雪山杜鵑，最低的是米林杜鵑。辛普森指數（D）從大到小依次為雪山杜鵑>雪層杜鵑>髯花杜鵑>米林杜鵑。將多樣性數據進行顯著性差異分析，P值為0.40，說明4種杜鵑屬植物內生真菌無顯著差異。

2.4杜鵑屬植物不同組織內生真菌的多樣性分析從杜鵑屬植物不同組織部位（根、莖、葉、花）的多樣性指數（表5）可以看出，Shannon多樣性指數（H′）從大到小依次為根>莖>葉>花，多樣性最高的是根，最低的是花。辛普森指數（D）從大到小依次為根>莖=花>葉。將多樣性數據進行顯著性差異分析，P值為0.39，說明4種杜鵑屬植物不同組織內生真菌無顯著差異。

3討論

該研究對西藏4種杜鵑屬植物720個組織塊進行分離得到336株內生真菌，鑒定為21屬55種。根、莖、葉和花組織中優勢屬都有曲霉屬、白僵菌屬和青霉屬。其中曲霉屬和青霉屬為許多藥用的草本植物和木本植物的優勢種［9］。有研究報道，青霉屬、曲霉屬、木霉屬、鏈格孢屬等在亮毛杜鵑（R.microphyton Franch）根際內生真菌中存在，其中青霉屬是優勢屬［24］；青霉屬、木霉屬在杜鵑種（R.simsii）根部內生真菌中發現，且為優勢屬［25］。子囊菌和木霉屬在馬纓杜鵑（Rhododendron delavayi）內生真菌中被報道，其中子囊菌為優勢菌群［26］。曲霉屬、擬隱殼孢屬、鐮刀菌屬和殼多胞菌屬在西藏米拉山雪層杜鵑的內生真菌中被分離發現［16］。該研究發現4種杜鵑屬植物內生真菌共有類型為曲霉屬、青霉屬、鏈格孢屬、白僵菌屬。其中白僵菌屬在其他杜鵑屬植物內生真菌鑒定中鮮見報道。

于洪佳等［27］研究報道青霉屬和曲霉屬具有抗菌、抗癌、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲、免疫調節等功效。曲霉屬和青霉屬都有生物堿類、聚酮類、萜類、肽類、固醇類和腦苷脂類等化合物［28］。從枝孢霉屬的次級代謝產物中分離出甾醇、倍半萜類、生物堿類、二酮哌嗪、芳香酸等化合物［29］?；@狀菌屬的次級代謝產物有萜類、生物堿類、聚酮類、聚酯類、醌類和甾體類，具有抗菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤活性、生物防治和產生酶活等作用，在食品、環境、農業和醫藥等方面發揮了重要作用［30］。毛殼屬真菌代謝產物的主要類型為細胞松弛素類和唑啉酮兩大類，包含細胞松弛素、唑啉酮類、二酮哌嗪類、色原酮、蒽醌等結構類型，表現出抗微生物、抗氧化、免疫抑制等生物活性，具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒等作用［31］。

綜上所述，該研究對西藏地區不同種杜鵑屬植物的不同組織內生真菌進行分離鑒定，發現種間真菌多樣性差異不明顯，同種植物不同部位內生真菌差異不明顯，說明4種內生真菌組成相似，且優勢屬都有曲霉屬、白僵菌屬和青霉屬。該研究結果為下一步內生真菌代謝產物研究提供基礎。

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