高效液相色譜法檢測小麥中嘔吐毒素測定方法優化探討*

劉 奕 薛 毅 王小慶 龍蘇舒 羅賢淑

(成都中儲糧質量監督檢測有限公司 610000)

嘔吐毒素(DON)又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,主要污染小麥、玉米、大麥等糧食作物及其制品。有研究表明嘔吐毒素具有致畸、胚胎毒性,對心肌細胞、血管內皮細胞、軟骨細胞等也有一定的毒性[1]。糧食衛生標準GB 2761-2017中規定小麥中嘔吐毒素限量為1000 μg/kg[2]。因此,小麥中嘔吐毒素含量的檢測成為中儲糧糧食入庫驗收、銷售出庫以及產新調查的必檢項目。

目前,GB 5009.111-2016中規定了嘔吐毒素的檢測方法有同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法(LC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)和酶聯免疫吸附篩查法(ELISA),另外還可以采用氣相色譜法(GC)、氣相色譜質譜聯用法(GC-MS)、膠體金免疫快速檢測卡、紅外光譜分析等方法檢測[3,4]。薄層色譜法由于其操作繁瑣、耗時長、靈敏度低和特異性差等特點現已很少采用;酶聯免疫法雖然操作簡單、分析時間短,但是特異性差、重復性差,結果存在一定的假陽性,適用于大批量樣品的定性檢測;免疫親和層析凈化—高效液相色譜法具有分析速度快、回收率高、準確性好、重復性好的優點,是目前實驗室檢測DON的重要手段[5,6]。本文優化了免疫親和層析凈化高效液相色譜法測定小麥中嘔吐毒素的前處理步驟,建立了操作簡便、準確性高、再現性好的嘔吐毒素含量的測定方法,更適用于檢化驗室日常批量檢驗業務的開展。

1 試驗方法

1.1 材料與試劑

嘔吐毒素免疫親和柱(1 mL柱管/支,柱容量>1000 ng);乙腈、甲醇(均為色譜純),實驗用水為UPR-2-10T超純水設備制備的超純水;全麥粉中嘔吐毒素成分分析質控樣品(編號TOXIN-JTZK-009,購于國家糧食和物資儲備局科學研究院,標準值為800 μg/kg±120 μg/kg);乙腈中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇溶液標準物質(濃度為100.7 μg/mL±3.2 μg/mL,購于國家糧食和物資儲備局科學研究院)。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀,配紫外檢測器(型號1260);離心機(型號TG16.5);多管渦旋混合器(型號SN-DMT-2500);固相萃取裝置(型號LC-CQ-24F);超純水設備(型號UPR-2-10T);電子天平(型號JJ500);自動分樣器(型號JFYZ);水分磨(型號3310);混粉儀。

1.3 嘔吐毒素標準溶液的制備

準確移取適量DON標準儲備溶液(100.7 μg/mL)用流動相稀釋,配置成100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5000 ng/mL的標準系列工作液,4℃保存,有效期7 d。在上述色譜條件下,將標準系列工作液由低到高濃度依次進樣檢測,分別測定其保留時間和峰面積。以嘔吐毒素標準工作液濃度為橫坐標,以峰面積積分值為縱坐標,作出標準曲線見圖1,并得到標準曲線回歸方程,如表1所示。

圖1 嘔吐毒素標準曲線

表1 嘔吐毒素標準工作液不同濃度對應的峰面積

1.4 試樣的制備

試樣采用全自動分樣器混勻5遍后,每份縮分至500 g±50 g,揀出雜質、礦物質得到凈糧,用水分磨碾磨后,于混粉器中混勻30 min。稱取5 g磨碎的試樣于50 mL離心管中,加入25 mL水提取,置于多管渦旋振蕩器中2500 r/min渦旋20 min,6000 r/min離心10 min,上清液備用。取2.5 mL上清液直接過免疫親和柱,加水10 mL淋洗。吹干免疫親和柱,用1.5 mL甲醇洗脫親和柱,在洗脫液中加入0.5 mL超純水,渦旋混勻30 s后過0.45 μm有機濾膜,收集濾液于進樣瓶中待測。

1.5 測定條件

色譜柱:島津C18柱(250 mm、4.6 mm、5 μm);流動相為10%乙腈-水;流速1 mL/min;柱溫40℃;進樣量20 μL;檢測器為紫外檢測器,波長218 nm。

2 結果與分析

2.1 靈敏度、檢出限、定量限

由表1可知,嘔吐毒素在100 ng/mL～5000 ng/mL濃度范圍內線性關系良好,其線性回歸方程為y=0.0741x,R2=0.99996。根據GB/T 5009.1-2003附錄A對靈敏度的規定:把標準曲線回歸方程的斜率b作為方法的靈敏度,因此,該方法檢測嘔吐毒素的靈敏度為0.0741。用濃度為100 ng/mL的嘔吐毒素標準溶液進行進樣分析,信噪比為320.4,由計算得出嘔吐毒素檢出限為1.873 μg/kg,定量限為6.243 μg/kg,均能滿足GB 5009.111-2016要求。

2.2 精密度

選擇濃度為1000 ng/mL的嘔吐毒素標準溶液進行5次測量,其結果見表2。

表2 精密度測試

由表2可知,根據GB/T 32465-2016(7.4)對精密度的要求,實驗條件下檢測嘔吐毒素的相對標準偏差、相對極差均符合實驗要求。

2.3 回收率

0.5 kg小麥用水分磨粉碎,過粒徑小于2 mm孔徑試驗篩,混合均勻,稱取四組雙平行試樣5 g(精確到0.01 g),一組為樣品空白,其余三組添加三個不同濃度梯度的標準溶液,換算為理論添加值,按上述方法進行嘔吐毒素含量測定,用加標回收實驗驗證方法的回收率,結果見表3。

表3 嘔吐毒素回收率測定結果

表3的結果表明,按不同水平定量添加嘔吐毒素標準溶液的回收率在99.90%～107.42%,平均回收率為102.9%,標準偏差為2.1%,相對標準偏差(RSD)為2.0%,符合GB/T 32465-2015(7.3)對檢測方法準確性要求。

2.4 質控樣品的測定

取嘔吐毒素質控樣品按照上述方法做1組雙試驗,測定結果分別為837和723,2次測定結果均在標準值允差范圍內,精密度滿足GB 5009.111-2016要求。質控樣品的液相圖譜如圖1及圖2所示。由圖1及圖2可以看出,質控樣品經過免疫親和柱凈化后的峰形較好,無明顯雜質峰,這說明經過優化后的實驗方法是可行的。

圖1 質控樣品嘔吐毒素檢測色譜圖1

圖2 質控樣品嘔吐毒素檢測色譜圖2

3 結論

采用優化后的免疫親和柱凈化高效液相色譜法檢測小麥中的嘔吐毒素,方法的檢出限為1.873 μg/kg,平均回收率在99.90%～107.42%。樣品的前處理過程不需要添加聚乙二醇及PBS緩沖鹽溶液,不需要氮吹過程,因此可有效避免氮吹時的壓力、溫度以及時間對待測成分可能帶來的影響。前處理操作更加簡化經濟,具有高效、準確、靈敏度高的優點,適用于糧油檢測機構日常檢驗工作的開展。