基于蛋白質相對分子質量與二級結構的阿膠珠炮制程度評價方法研究

阿娜爾，劉 芬，許銘珊，孫 靜，李 宇，陳建波，董 玲*

（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488；2.北京中醫藥大學生命科學學院，北京 102488）

阿膠為馬科動物驢（Equus asinus L.）的干燥皮或鮮皮經煎煮、濃縮制成的固體膠，具有補血滋陰、潤燥、止血等功效?！吨腥A人民共和國藥典》2020 年版[1]（以下簡稱《中國藥典》2020 年版）收錄了阿膠、阿膠珠兩種飲片規格。阿膠珠為阿膠丁加蛤粉燙制而成，能降低滋膩之性，矯正不良氣味，便于調劑與服用，還能借蛤粉增強清熱化痰之功效[2，3]。蛋白質和多肽是阿膠中的主要活性成分[4]，蛋白質受熱易發生變性，阿膠丁加熱膨化為阿膠珠時，若加熱不足，蛋白質變性不夠，則阿膠丁無法充分膨化，內含溏心；若加熱太過，蛋白質嚴重熱解，則阿膠珠焦化，藥效降低?，F行藥典及地方炮制規范對于阿膠珠炮制程度均缺少量化評價指標，故建立阿膠制珠炮制程度量化評價指標，有助于完善阿膠珠炮制規范，可有效控制并優化阿膠珠生產工藝及成品質量。因此，本研究嘗試利用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）表征蛋白質相對分子質量分布，利用傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）表征蛋白質二級結構，以反映阿膠受熱后的蛋白質變性程度。探索根據蛋白質相對分子質量與二級結構評價阿膠珠炮制程度的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

阿膠珠A（采購于北京某藥房）；阿膠珠B、C、D（分別采購于3家四川制藥公司）；阿膠（由阿膠珠D的生產廠家提供）；牛血清白蛋白（純度：96%，相對分子質量約6.64×104Da，上海源葉生物科技有限公司）；細胞色素C（純度：95%，相對分子質量約1.25×104Da，北京萬佳標準物質研發中心）；磷酸二氫鈉（AR，北京化工廠）；氫氧化鈉（AR，天津市大茂化學試劑廠）；純凈水。

1.2 阿膠珠水分與灰分測定

取適量阿膠珠樣品粉末，用DSH-50A-1型鹵素快速水分測定儀（上海佑科）測定其水分含量。

按《中國藥典》2020年版[1]四部通則2302進行總灰分含量測定。

1.3 阿膠珠溶化性測定

在250 mL 燒杯中注入200 mL 80 ℃熱水，稱取2.95～3.05 g阿膠珠，放入燒杯后不斷攪拌，記錄阿膠珠全部溶解所需要的時間，靜置后觀察燒杯底部沉淀量。

1.4 凝膠滲透色譜（GPC）

1.4.1 對照品溶液 取牛血清白蛋白、細胞色素C標準品適量，精密稱定，加水制成每1 mL 含牛血清白蛋白1.0 mg、細胞色素C 1.0 mg 的混合溶液，用0.45 μm水系微孔濾膜濾過，即得。

1.4.2 供試品溶液 取阿膠或阿膠珠樣品250 mg，加水約20 mL，超聲（300 W，50 kHz）處理1 h，放冷，加水定容至25 mL，搖勻，用0.45 μm 水系微孔濾膜濾過，即得。

1.4.3 色譜儀器與條件 本研究所用色譜系統為LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-M20A紫外檢測器、SIL-20A 自動進樣器（日本島津），色譜柱為TSKgel G4000PWXL（7.8mm30cm，10μm），流動相為0.05mol·L-1、pH=7.2 的磷酸鹽緩沖溶液，流速0.4 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長280 nm，進樣體積5 L。

方法學考察：分別取對照品溶液、供試品溶液及磷酸鹽緩沖溶液按照上述條件進行測定，譜峰分離度大于1.5，磷酸鹽緩沖溶液無明顯干擾；取對照品溶液按照上述色譜條件連續進樣6 次，色譜峰面積RSD值小于1.5%，表明此方法精密度良好；取阿膠樣品6份，每份250 mg，按“1.4.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測試，色譜峰（t=25.5 min）面積RSD值小于2.5%，表明此方法重復性良好。

1.5 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）

本研究所用儀器為VERTEX 70 傅里葉變換紅外光譜儀（德國布魯克），配有Platinum ATR 衰減全反射附件。用無水乙醇清潔附件的內反射晶體表面后，掃描空氣背景光譜，然后將適量樣品粉末置于內反射晶體表面，用裝置自帶壓桿壓緊，掃描樣品光譜。光譜范圍4000～400 cm-1，光譜分辨率4 cm-1，單張光譜累積掃描32 次。原始光譜先進行ATR 校正（接觸因子設為0），然后進行自動基線校正與縱坐標歸一化處理，使2000～800 cm-1區域內最高吸光度為1、最低吸光度為0。

2 結果

2.1 加熱程度對阿膠蛋白質相對分子質量的影響

阿膠中蛋白質（以及多肽）的含量為70%～90%[4]。由于驢皮原料、添加輔料等的差異，不同廠家或者不同批次阿膠中蛋白質含量可能波動較大，故難以根據蛋白質含量評價不同阿膠珠的炮制程度。加熱可能導致阿膠中蛋白質發生熱解，因此，可以考慮根據蛋白質相對分子質量變化來判斷阿膠及阿膠珠的加熱程度。

驢皮含有的蛋白質種類較多，在阿膠的生產過程中蛋白質發生不同程度的水解，從而產生一定的相對分子質量分布輪廓?；谀z滲透色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳、高分辨質譜等技術的研究結果表明，大部分阿膠的蛋白質相對分子質量在5103 ～2.5105Da范圍內[5～7]。不同廠家阿膠的蛋白質相對分子質量分布有一定程度的差異，可能與生產過程中蛋白質水解程度有關[8]。如圖1左所示，本研究使用的阿膠中大部分蛋白質的相對分子質量在104～105數量級上連續分布，符合文獻報道的市售阿膠的凝膠色譜圖特征。

圖1 左 阿膠不同溫度烘烤后的蛋白質GPC圖

圖1 右 阿膠不同溫度烘烤后的FTIR圖

《北京市中藥飲片炮制規范》（2008 年版）規定燙制阿膠珠的蛤粉溫度為140 ℃～160 ℃，已有對于阿膠珠炮制工藝的研究使用的加熱溫度一般為120 ℃～180 ℃[9～11]。故本研究考察了200 ℃以內的燙制溫度對于阿膠蛋白質相對分子質量的影響。如圖1 左所示，在不超過140 ℃的溫度下加熱20 min，阿膠蛋白質的相對分子質量分布未發生明顯變化。加熱溫度達到160 ℃或者更高時，保留時間25 min附近的最強色譜峰逐漸右移，說明蛋白質相對分子質量呈現整體降低趨勢。保留時間45 min 附近的色譜峰在160 ℃加熱時開始出現，加熱溫度越高，該峰強度越大，說明該峰可能對應阿膠蛋白質的熱解產物。由此推測，若蛤粉溫度為140 ℃～160 ℃，阿膠燙制成珠后的蛋白質分子沒有發生明顯熱解，相對分子質量分布輪廓未發生直觀變化。

2.2 加熱程度對阿膠蛋白質二級結構的影響

根據上一節的分析，相對分子質量分布輪廓能夠清晰判斷阿膠珠是否炮制太過（蛋白質產生明顯熱解），但對于炮制終點之前的蛋白質性質變化并不敏感。理論上說，即便蛋白質分子的一級結構沒有變化（此時相對分子質量不變），其二級結構的變化也會導致紅外光譜上酰胺Ⅰ帶（主要為酰胺鍵C=O 伸縮振動吸收峰）和酰胺Ⅱ帶（主要為酰胺鍵N-H 彎曲振動吸收峰）的峰位置、強度或形狀的變化。因此，本研究使用能夠反映蛋白質二級結構差異的紅外光譜，以更加敏銳地評價阿膠珠炮制程度。

如圖1右所示，阿膠的紅外光譜中3 281 cm-1為氨基N-H 與羥基O-H 伸縮振動吸收峰的疊加，2 923 cm-1和2 853 cm-1為亞甲基C-H反對稱和對稱伸縮振動吸收峰，1 744 cm-1為酯羰基C=O伸縮振動吸收峰，1 631 cm-1和1 537 cm-1為蛋白質酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶吸收峰，1 450 cm-1為C-H彎曲振動吸收峰，1 237 cm-1為C-O伸縮振動吸收峰。上述吸收峰中，2 923 cm-1、2 853 cm-1和1 744 cm-1等主要來自油脂類成分，可以反映阿膠中輔料豆油的多少。1 631 cm-1和1 537 cm-1是蛋白質的特征吸收峰，其位置、強度或形狀受到蛋白質二級結構的影響。

根據文獻報道[6]，阿膠生產過程中的煎煮等處理步驟可能嚴重破壞蛋白質的空間結構，故不同企業所產阿膠的蛋白質構象無明顯差異，均呈無規則卷曲狀態。如圖1右所示，阿膠經不同溫度加熱后，酰胺Ⅰ帶沒有明顯變化，而酰胺Ⅱ帶呈現明顯的紅移現象，后者可以反映阿膠蛋白質的二級結構變化程度[12]。未加熱的阿膠酰胺Ⅱ帶位于1 537 cm-1，80 ℃加熱后即明顯紅移至1 525 cm-1。加熱溫度升高到100 ℃～140 ℃時，阿膠酰胺Ⅱ帶紅移至1 520 cm-1附近。加熱溫度升高到160 ℃～200 ℃時，阿膠酰胺Ⅱ帶紅移至1 515 cm-1附近。相對于蛋白質，油脂類成分的熱穩定性更高，所以加熱溫度不高于140 ℃時，2 923 cm-1、2 853 cm-1和1 744 cm-1等油脂類成分特征峰的位置沒有發生改變。加熱溫度高于160 ℃時，2923cm-1和2853cm-1兩個特征峰發生藍移，1744cm-1峰發生紅移，且1 710 cm-1附近的吸收強度有所增加，顯示一部分甘油三酯可能發生熱解，產生游離脂肪酸（其羰基C=O伸縮振動吸收峰在1 710 cm-1附近）。

綜上所述，根據凝膠色譜表征的蛋白質相對分子質量分布，特別是保留時間25 min 附近色譜峰的位置、保留時間45 min 附近色譜峰的強度，可以區分加熱溫度140 ℃、160 ℃的阿膠。根據紅外光譜表征的蛋白質二級結構，特別是酰胺Ⅱ帶的峰位置，可以反映阿膠加熱溫度從60 ℃到200 ℃的逐漸升高。

2.3 市售阿膠珠的性狀特征比較分析

2020 年版《中國藥典》對阿膠珠的性狀描述為“呈類球形。表面棕黃色或灰白色，附有白色粉末。體輕，質酥，易碎。斷面中空或多孔狀，淡黃色至棕色?！币虼?，本研究從外觀顏色、質地、內部性狀等角度對4 種市售阿膠珠的性狀特征進行了比較，同時也對其溶化性及水分、總灰分含量進行了比較，結果見圖2、表1。結果可知，阿膠珠A、B、C、D外觀性狀特征均符合2020年版《中國藥典》要求。

表1 4種市售阿膠珠的性狀特征測定結果

圖2 4家企業生產的阿膠珠

根據現行《中國藥典》對阿膠珠炮制工藝的規定，阿膠需要先切成1 cm 左右的丁，然后用蛤粉燙至成珠。雖然藥典未明確規定成品阿膠珠的尺寸，但是可以推測其直徑應不小于1 cm?！渡虾Ｊ兄兴庯嬈谥埔幏丁穂13]（2018 年版）規定阿膠珠“直徑2 ～2.5 cm”，《浙江省中藥飲片炮制規范》[14]（2015 年版）規定阿膠珠“直徑2 ～4 cm”。由此可知，符合藥典炮制工藝的傳統阿膠珠的直徑一般在2 cm 左右。由圖2 可知，只有阿膠珠A 的炮制工藝可能符合藥典要求。但是阿膠珠A 的內部有溏心，未達到藥典要求的炮制程度。阿膠珠B、C、D 的直徑明顯偏小，內無溏心，說明這3種阿膠珠的加熱程度應當高于阿膠珠A。

由圖2、表1所示，阿膠珠A和B黏附蛤粉較多，故其灰分含量高，對于顏色、質地也有明顯影響。因此，難以從表面顏色、內部性狀、質地等角度評價幾種阿膠珠炮制程度的相對高低。另外，阿膠珠A和B溶解速度較慢。這可能由于炮制不足導致膨化程度不夠，也可能是由于炮制太過導致蛋白質焦化、難以溶解，還在一定程度上受到蛤粉含量的影響。

由此可知，內部是否有溏心能夠直觀評價阿膠珠炮制程度，但是這只能判斷是否炮制不及（例如阿膠珠A），不能判斷是否炮制太過。

2.4 市售阿膠珠的蛋白質相對分子質量比較分析

由圖3 左所示，阿膠珠D 與其原料阿膠的蛋白質相對分子質量分布輪廓基本一致，在45 min 處沒有明顯的熱解產物峰。這說明阿膠珠D 的炮制過程未顯著影響蛋白質一級結構。由圖4 可知，烘烤溫度不超過120 ℃時，所有阿膠珠的蛋白質相對分子質量分布輪廓均無明顯改變，在45 min 處也無明顯的熱解產物峰；烘烤溫度達到180 ℃時，所有阿膠珠的蛋白質相對分子質量分布輪廓均發生明顯改變，在45 min處出現明顯的熱解產物峰。由此推測，4種阿膠珠所含蛋白質的一級結構在炮制過程中均無顯著改變，不同阿膠珠蛋白質相對分子質量分布輪廓的差異源自其阿膠原料的不同。

圖3 左阿膠與4種市售阿膠珠的蛋白質GPC圖

圖3 右阿膠與4種市售阿膠珠FTIR圖

圖4 4種市售阿膠珠不同溫度烘烤后的蛋白質GPC圖

如圖3 右所示，阿膠珠A 的最強峰保留時間約為23 min，阿膠珠B 的最強峰保留時間約為24 min，阿膠珠C、D 的最強峰保留時間約為25 min。此外，阿膠珠A、B 在12 ～16 min 區域的色譜峰強于阿膠珠C、D。這說明阿膠珠A的蛋白質平均相對分子質量最大，而且阿膠珠A、B 中都有一些相對分子質量較大的蛋白質。如圖4所示，200 ℃烘烤后阿膠珠A的最強峰保留時間約為25 min，阿膠珠B、C、D 的最強峰保留時間位移至27 min 附近。再次說明阿膠珠A 的蛋白質平均相對分子質量最大。根據前述性狀特征分析，阿膠珠A 內有溏心且溶解速度較慢，這可能與其蛋白質平均相對分子質量最大有關。140 ℃烘烤后阿膠珠B 中已經出現45 min 處的熱解產物峰，160 ℃～200 ℃烘烤后阿膠珠B的該峰明顯強于其他阿膠珠。這表明阿膠珠B的蛋白質在炮制過程中的變性程度可能高于其他阿膠珠，故受熱后更易分解。實驗發現，烘烤溫度越高，阿膠與阿膠珠樣品越難以在水中溶解。因此，阿膠珠B 的溶解速度較慢，可能由于炮制過程受熱程度較高所致。根據上述分析，可以初步推測炮制過程中加熱程度最低的為阿膠珠A，加熱程度最高的為阿膠珠B。

2.5 市售阿膠珠的蛋白質二級結構比較分析

如圖3 右所示，阿膠珠D 與其原料阿膠的酰胺Ⅱ帶峰位置有明顯差異，前者在1 537 cm-1，后者在1 522 cm-1，反映了阿膠制珠后蛋白質二級結構的變化。根據“2.2”節所述的酰胺Ⅱ帶位移規律，阿膠珠D制備時的有效加熱溫度可能在100 ℃左右。由于阿膠珠D 的尺寸小于2 cm，故其膨化時可能不需要將蛤粉預熱到較高溫度（例如140 ℃～160 ℃）。阿膠珠A、B、C的酰胺Ⅱ帶也都低于1 525 cm-1，但由于未知其所用阿膠原料的紅外光譜，故無法直接判斷三者制珠前后的酰胺Ⅱ帶位移大小。

本研究假設阿膠珠炮制過程中的蛋白質二級結構變化基本為不可逆，若阿膠炮制成珠時以T 溫度加熱，所得到的阿膠珠再次加熱到不高于T溫度時，其蛋白質二級結構與室溫阿膠珠的差異預期較小?；谠摷僭O，在未知其阿膠原料的情況下，將不同阿膠珠用相同溫度加熱，比較加熱前后酰胺Ⅱ帶位移大小，可以初步推測不同阿膠珠在炮制時的受熱程度高低。如圖5 所示，不同阿膠珠在加熱后的酰胺Ⅱ帶均發生紅移。根據“2.4”節的分析結果，所有阿膠珠在炮制階段均無明顯的蛋白質熱解，故其等效加熱程度應當不超過本研究所用的140 ℃烘烤。比較阿膠珠在室溫與140 ℃烘烤后的酰胺Ⅱ帶位移值，阿膠珠A 為8 cm-1，阿膠珠B 為3 cm-1，阿膠珠C為5 cm-1，阿膠珠D為7 cm-1。由此推測，炮制階段經歷的加熱程度最低的是阿膠珠A，加熱程度最高的是阿膠珠B，這亦與“2.4”節的推測結果一致。

圖5 4種市售阿膠珠不同溫度烘烤后的FTIR圖

3 討論

本研究從性狀特征、蛋白質相對分子質量、二級結構等角度，對4 種市售阿膠珠在炮制階段可能經受的加熱程度進行了比較分析。初步得出，利用性狀特征以及蛋白質相對分子質量分布難以直接判斷阿膠珠在炮制階段的加熱程度相對高低，而根據蛋白質二級結構對應的紅外光譜特征峰，可以直接對炮制不及、適中到太過的阿膠珠加熱程度相對高低進行比較。將阿膠珠樣品再次加熱后，根據蛋白質相對分子質量與二級結構的熱響應結果可以間接評價阿膠珠的炮制程度，但是操作較復雜，有一定局限性。綜上所述，紅外光譜法可作為物質基礎層面上客觀量化阿膠珠炮制程度的評價方法，此法適用于炮制不及、適中到太過的大范圍樣品評價。然而，受到加熱設備及阿膠丁尺寸等影響，本研究所用加熱條件無法簡單移植于阿膠珠生產設備，故此方法在實踐中的準確性和耐用性還需要更多樣品進行驗證。

蛋白質為許多動物、植物藥的主體成分。在研究此類藥材的炮制機制與終點指標時，蛋白質相對分子質量與二級結構都是值得考慮與嘗試的方面。