那如三味片防治類風濕性關節炎的有效成分預測與靶點通路分析

杜曉鸝，金義輝，朱彥，蘇佳，李剛*

（1.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010059；2.天津中醫藥大學，天津 301617；3.內蒙古國際蒙醫醫院呼吸與危重癥醫學科，內蒙古 呼和浩特 010013）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一類以慢性關節滑膜炎和骨損傷為主要特點的慢性炎癥性自體免疫病變，可導致嚴重殘疾[1]。其一般侵害周圍重要關節，并造成重要關節結構的破壞、畸形和功能損害。主要特征表現為手、腳小關節的發炎，并往往伴隨著重要人體關節外器官損傷或血清類風濕因子陽性，同時也可伴隨體質量的驟降、低熱量和疲倦感等身體表現。更多的證據指出，RA患者會面臨更多的并發癥的風險，包括感染、惡性腫瘤和急性冠狀動脈綜合征[2～4]。目前還不完全了解這種疾病發生的機制。有研究提出，不同的環境因素，如吸煙、職業和大氣因素可觸發刺激易感個體基因的RA 的發展，導致滑膜增生和骨骼破壞。RA 的最初發病階段與先天和適應性免疫的變化密切相關，隨后形成了自身抗體，主要針對不同分子，也包括經過修改后的自我表位。在發病的以下階段，先天的（如樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞）和適應性免疫細胞（如B 淋巴細胞和T 淋巴細胞）都有助于慢性炎癥狀態的擴增和持續。對RA發病機理中的重要細胞結構、介質和機制的認識，為開發新型精確的疾病修飾抗風濕藥物提供了基礎[5]。

目前治療類風濕性關節炎藥物主要包括疾病修飾劑（DMARDs），如磺胺嘧啶和甲氨蝶呤，以及最近使用的“生物制劑”，如抗TNF-α 藥物[6]?，F階段人們廣泛采用中西醫結合方式來治療和控制類風濕性關節炎的進展。那如三味（NRSW）片是中國傳統蒙藥，具消“黏”、除“協日烏素”、祛風、鎮痛、散寒功效。其主要適用于風濕、關節酸痛、腰腿冷疼、牙痛、白喉等病癥。其由制草烏、蓽茇、制訶子組成，該三味藥均為中、蒙醫使用的傳統植物藥。方中草烏殺黏、止痛、燥黃水為主；訶子調理體素為輔；蓽茇補胃火、祛巴達干赫依為之佐使。三藥聯用，對寒性黃水病、皮膚蟲病、白喉、炭疽等“黏”病均有功效[7，8]。然而，由于蒙藥基礎研究的起步相對較晚，對其物質基礎和作用機理仍缺乏深入的研究[9]。

網絡藥理學為新型科學，融合并運用了網絡系統生理學、多向藥理學、計算生理學、網絡系統分析方法等多學科專業的研究手段與教學內容，以實現立體化網絡系統的建構，從系統整合的視角去探討醫藥與病理之間的聯系，其整體性、系統性的特點，與傳統中醫藥對處理疾病的總體觀點和辨證論治基本原則相吻合。

1 資料與方法

1.1 那如三味片的化學成分數據庫構建

利用TCMSP（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），Version 2.0[10]并結合BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/ index. php/）[11]數據庫，搜集“草烏”“蓽茇”“訶子”主要化學成分。

1.2 活性物質篩選

本課題以口服給藥的生物利用度（oral bioavailability，OB）閾值OB≥30%和類藥性（druglikeness，DL）閾值DL≥0.18 為主要活性物質的檢測要求[12]，將TCMSP 中有較高活性的物質加以檢測，增加數據分析處理的價值。BATMAN-TCM 數據庫中通過設置Score cutoff to 20 及Adjusted P_value cutoff to 0.05相關參數進行活性化合物的篩選提取。

1.3 活性成分-作用靶點數據庫構建

利用TCMSP檢索活性成分靶點，整理收集到靶點導入Uniprot（https://www.uniprot.org/uniprot/）以及Inparanoid8（http://inparanoid.sbc.su.se/cgi-bin/index.cgi）數據庫，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱，剔除沒有靶點的活性成分。

1.4 類風濕性關節炎疾病數據庫構建

在PALM-IST 數據庫（http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm/palmist_server.html）和COREMINE 數據庫（https://www.coremine.com/medical/）中搜索關鍵詞“rheumatoid arthritis”收集疾病相關靶點，整理后建立類風濕性關節炎相關靶點數據集。利用活性成分靶點與類風濕性關節炎靶點之間的匹配，得到那如三味片治療類風濕性關節炎的潛在靶點，從而構建潛在靶點數據集。

1.5 那如三味片治療類風濕性關節炎網絡構建

利用IPA（ingenuity pathway analysis）應用程序，通過輸入那如三味片活性成分的靶點建立藥物和疾病互作網絡圖。

1.6 疾病、功能和通路分析

通過IPA 技術對那如三味片治療類風濕性關節炎潛在靶點進行核心分析，以獲取與其相關疾病、功能和通路等的有關信息，分析預測那如三味片治療類風濕性關節炎的可能作用機制。

1.7 分子對接驗證

從小分子數據庫zink（https://zinc.docking.org/）下載小分子文件，從RCSB PDB（https://www.rcsb.org）下載大分子蛋白，通過Autodock 軟件對小分子和蛋白進行處理、對接，計算結合能。

2 結果

2.1 那如三味片活性化合物篩選

通過TCMSP 和BATMAN-TCM 數據庫共收集到那如三味片化合物172 種，其中草烏含27 種、蓽茇含104種、訶子含41種。以OB≥30%、DL≥0.18及Score cutoff to 20、Adjusted P_value cutoff to 0.05 作為篩選條件，篩選出生物活性物質共33 種，其中草烏含10種、蓽茇含15種、訶子含8種。

2.2 那如三味片活性化合物-作用靶點數據庫構建

應用TCMSP 和BATMAN-TCM 分析平臺，得到那如三味片各活性化合物的靶點信息，經去重后得到172個靶點。

2.3 疾病數據庫構建

在PALM-IST 和COREMINE 數據庫搜索關鍵詞“rheumatoid arthritis”，共獲取6 450個類風濕性關節炎相關靶點。將那如三味片活性成分靶點和類風濕性關節炎靶點匹配后，得到124 個那如三味片治療類風濕性關節炎潛在靶點。

2.4 那如三味片治療類風濕性關節炎網絡的構建

將那如三味片活性成分靶點通過IPA應用程序錄入數據庫，建立“New My Pathway”，通過“Diseases and Functions”搜索“Rheumatoid arthritis”將其加入同一個“New My Pathway”，利用“Tool-Path Explorer”功能分別構建那如三味片及草烏、訶子、蓽茇治療類風濕性關節炎網絡圖，詳見圖1、圖2（A、B、C）。通過IPA 網絡分析預測出47 個那如三味片治療類風濕性關節炎的作用靶點，主要包括細胞/增長因子：CXCL8、TNF、TNFSF11、IL6、IL10、IL1B、VEGFA；G蛋白偶聯受體：ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、ADRB2、OPRD1、DRD2、OPRM1、HTR2A、ICAM1；轉運體：SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、ABCB1；代謝酶：MAOA、MAOB、CYP1A2、CYP2B6、DPAGT1、PTGS2、CA2、ACLY、PTGS1、XIAP、ACHE；離子通道：KCNJ15、GABRA1；激酶：LRRK2、CCNB1；核受體：PGR；肽酶：MMP9、MMP2、IGHG1、F10、CASP3；轉錄調節：NFKBIA、NCOA2、FOS、TP53 等。那如三味片各成分中，發揮治療類風濕性關節炎的有效成分主要有草烏中的脫氧烏頭堿（Deoxyaconitine）、烏頭堿（Aconitine）、中烏頭堿（Mesaconitine）、次烏頭堿（Hypaconitine）、惰堿（Ignavine）等；蓽茇中的蓽茇壬三烯哌啶（Dehydropipernonaline）、胡椒堿（Piperine）、蓽茇明寧堿（Piperlonguminine）等；訶子中的碎葉紫堇堿（Cheilanthifoline）、霹靂蘿芙辛堿（Peraksine）等。由表1 可知，那如三味片中不同活性成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，體現其多成分、多靶點的協同作用。其中草烏活性成分主要作用靶點為多巴胺轉運體（SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4），它們是哺乳動物SLC6（溶質載體6）家族中的成員，所有SLC6 轉運體均為Na+/Cl-依賴的質膜轉運體，根據SLC6 轉運體進化關系可以進一步劃分為4 個亞科，單胺轉運體即去甲腎上腺素的轉運體（SLC6A2）、多巴胺（SLC6A3）、血清素即5-羥色胺（血管收縮素）（SLC6A4），此3種同屬于一個亞科[13]。

圖1 那如三味片治療類風濕性關節炎網絡圖

圖2 藥物中各成分治療類風濕性關節炎網絡圖A.草烏治療RA網絡圖；B.訶子治療RA網絡圖；C.蓽茇治療RA網絡圖

2.5 疾病、功能及通路分析

那如三味片活性成分靶點和類風濕性關節炎靶點匹配后，得到124 個那如三味片治療類風濕性關節炎潛在靶點。通過IPA 可以對這些潛在靶點進行核心解析，得到這些生物分子所涉及的主要疾病包括神經性疾病、組織損傷和畸形、心理障礙、炎癥疾病、免疫調節失常等（見圖3）。主要通路包括5-羥色胺受體信號、G蛋白偶聯受體信號、磷酸腺苷活化蛋白激酶信號等（見圖4）。這提示了類風濕性關節炎病情的發生發展進程與5-羥色胺受體的結合活性、炎癥、免疫調節等密切相關。其中ADRB2、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、MAOA、PTGS1、PTGS2、SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4、IL6、IL10、IL1B、TNF 等基因在類風濕性關節炎疾病發生發展中可能有重大影響，如參與腺苷酸環化酶抑制的G 蛋白偶聯受體信號通路、腺苷酸環化酶抑制5-羥色胺受體信號通路、骨重塑、5-羥色胺受體代謝等生物過程，各通路對應的作用靶點見表2。

表2 各通路權重及對應作用靶點

圖4 生物分子蛋白通路排序

2.6 那如三味片對類風濕性關節炎作用靶點分子對接結果分析

分子對接展示圖（見圖2）展示了配體與蛋白分子間的相互作用。分子對接結果（見表3、圖5）顯示那如三味片與多個靶點形成氫鍵作用，結合能≤-1.2 Kcal/mol，構象能量低，結構穩定，具有較好活性。

表3 碎葉紫堇堿(Cheilanthifoline)、玫瑰樹堿（Ellipticine）胡椒堿(Piperine)與ADRB2、PTGS2、SLC6A4的分子對接

圖5 那如三味片對類風濕性關節炎作用靶點分子對接展示圖

3 討論

類風濕性關節炎（RA）是一類慢性炎癥病變，滑膜炎為其主要的病變特點。白細胞浸潤和滑膜細菌的活化，導致了軟骨和骨的損傷。而日益增多的研究資料也證實了致炎細胞因子造成的發炎、細菌繁殖和激活在RA 的發生機理上起到了關鍵性作用。本文通過網絡藥理學方法分析探討了蒙藥那如三味片治療類風濕性關節炎的主要活性成分、作用靶點及通路。這些作用靶點主要包括單胺氧化酶A基因（MAOA）、腎上腺素能受體基因（ADRA1D、ADRA2B）、多巴胺轉運體基因（SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4）、細胞/增長因子（IL6、IL10、TNF）等；通路主要包括5-羥色胺受體信號、G 蛋白偶聯受體信號、磷酸腺苷活化蛋白激酶信號等。

血清素（5-羥色胺）是一種神經遞質，在腦內平衡中起著重要作用。最新的研究表明，血液中的5-羥色胺是成骨細胞生成的調節因子，可以抑制骨形成[14]。因此，測量血清中5-羥色胺水平對診斷RA具有一定的臨床意義。本文對那如三味片治療類風濕性關節炎進行系統網絡藥理學分析得出主要通路包括5-羥色胺受體信號，在文獻中得到證實。

G 蛋白偶聯受體（GPCRs）是一種跨膜受體蛋白，是膜蛋白中最大的家族，有人類基因組中的800多個基因編碼。GPCRs 包含7 個跨膜螺旋束，為配體提供結合位點[15]。GPCRs中含有許多特異性免疫受體，如β2-腎上腺素能受體（β2-AR）、前列腺素E2（PGE2）受體、趨化因子受體、腺苷受體等。這些受體通過介導細胞外刺激（包括光、蛋白質、肽、小分子、激素、質子和離子）的信號轉導，積極參與細胞的病理和生理過程[16]。GPCRs信號通路在炎癥和免疫反應過程中發揮重要作用，包括類風濕性關節炎[17]。本文經系統網絡藥理學分析得出那如三味片治療類風濕性關節炎主要通路包括G 蛋白偶聯受體信號，與文獻中的報道一致[14]。

網絡藥理學分析結論提示草烏的主要活性成分脫氧烏頭堿（Deoxyaconitine）、烏頭堿（Aconitine）、中烏頭堿（Mesaconitine）、次烏頭堿（Hypaconitine）、惰堿（Ignavine）、北烏頭堿（Beiwutine）、異烏頭堿（Isoaconitine）和紫草烏堿（Delavaconitine）主要參與了5-羥色胺受體信號通路（HTR1B、HTR3A、SLC6A4、MAOA）和多巴胺受體信號通路（SLC6A3、MAOA）。SLC 類可溶性載體成為細菌膜上的主要信號傳導者，是藥物進出細胞的關鍵，在體內藥物的處置過程、有效性以及不良反應等方面起至關重要的作用[18]。治療類風濕性關節炎的藥物多為轉運體底物，如柳氮磺胺吡啶和甲氨蝶呤等。了解類風濕關節炎下轉運體的變化對于藥代學、藥效學研究和指導臨床用藥至關重要[19]。值得注意的是，草烏對腎臟的毒性主要通過SCN10A和SCN5A離子通道作用于3 個G 蛋白偶聯受體靶點（ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C），對心臟毒性主要作用于HSP90AB1 靶點。這些靶點全部來自于草烏中的惰堿（Ignavine）。草烏成分相當復雜。研究已證實其有毒成分主要依賴雙脂型烏頭酸的水解及分解程度，動物試驗證實生草烏水煎劑在約2 h 時毒害程度最高，約4 h 時毒害程度則明顯降低。動物中毒試驗研究亦表明，生草烏潛在具有人體心血管循環網絡系統、神經、腎、胚胎、生殖毒性作用等，因此妊娠期應禁用。烏頭堿中毒目前還缺乏特效的解毒品，防治的關鍵是適時、合理地糾正慢性心律失常，保持生命體征穩定，并同時給予洗胃、靜脈注射補液等處理措施。本文采用了網絡藥理學、分子對接的分析方法，得出了草烏腎毒與心臟中毒反應有關的主要活性成份和靶點，為進一步確定其中毒反應的化學物質基礎、中毒反應機理，以及與炮制藥劑配伍的經濟增效減脂機理，提供了依據[20]。惰堿是否對腎臟和心臟產生毒性及如何在炮制、提取等工藝中對草烏進行減毒、去毒從而使那如三味片更加有效、安全地發揮治療類風濕性關節炎的作用，有待后續進一步研究。綜上所述，那如三味片網絡藥理學研發平臺的形成，不但對明確該蒙藥治療類風濕性關節炎的物質基礎和作用機制及臨床作用特點、指導臨床定位和合理用藥具有重要意義，而且也為建立質控指標體系、設計與優化蒙藥產品制備工藝流程等提供了依據。