自擬中藥方對隱性乳腺炎奶牛乳腺組織炎癥信號通路的影響

王 麗 杜冬華 李忠浩 周 靜

（河北北方學院 動物科技學院預防獸醫學重點實驗室，河北 張家口 075131）

奶牛乳腺炎主要是一種由病原微生物感染引起的乳腺組織的炎癥反應，可導致牛奶產量和質量下降。近年來，奶牛隱性乳腺炎的發病率越來越高，使養殖業造成了經濟損失[1]。臨床治療奶牛乳腺炎主要依賴抗生素，在早期取得了良好的治療效果，但隨著用藥時間延長，導致病原菌廣泛產生耐藥性，且藥物殘留問題會危害人類和動物的健康[2]。此外，疫苗對乳腺炎的預防效果并不理想，也對該病的防治提出了更高要求[3]。因此，需要尋找和開發治療奶牛乳腺炎新的有效藥物。

研究表明，炎癥細胞在乳腺組織聚集并分泌促炎細胞因子，是乳腺炎發生的先決條件[4-5]。諸多研究表明，激活的有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路可通過促進白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等釋放介導炎癥反應，且抑制MAPK和NF-κB信號通路可顯著緩解脂多糖（LPS）誘導的小鼠乳腺炎[6]。此外，含NLR 家族Pyrin 域蛋白3（NLRP3）炎性小體是最具特征性的炎癥體，與炎癥反應密切相關，可促進IL-1β 和IL-18 成熟[7]。因此，調節NF-κB、MAPK和NLRP3 信號通路可能是治療奶牛乳腺炎的有效策略。中藥治療奶牛乳腺炎具有不易產生耐藥性、低殘留、毒副作用小等優勢[8]。本研究所用自擬中藥方由黃芪、金銀花、蒲公英等14味中藥組成，經課題組前期試驗證明可治愈奶牛隱性乳腺炎（治愈率為63.38%，有效率為93.33%），增加產奶量[9]，但其抗炎機制尚未闡明?；诖?，本研究旨在探究該中藥組方的抗乳腺炎的分子機制，以期為闡明該方劑的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

IL-1β、IL-8 和TNF-α ELISA 檢測試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；兔抗牛NF-κB p65、Phospho-NF-κB p65、p38 MAPK、Phospho-p38 MAPK抗體，購自Cell Signaling Technology 公司；兔抗牛β-actin抗體購自Abcam公司；兔抗牛ERK1/2、Phospho-ERK1/2、JNK1/2/3、Phospho- JNK1/2/3、NLRP3 抗體，購自Affinity公司；HRP標記羊抗兔IgG購自天津三箭生物技術有限公司；ECL 化學發光檢測試劑盒購自蘇州宇恒生物公司；RIPA組織裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Beyotime公司。

全自動活檢穿刺槍購自美國Bard公司。

1.2 中藥乳房灌注劑制備

稱取黃芪、金銀花和蒲公英各30 g，大青葉、青皮、紫花地丁、王不留行、連翹、瓜蔞、赤芍、當歸、乳香和通草各15 g，甘草10 g。按照本課題組在文獻[9]中報道的方法制備，中藥煎劑在旋轉蒸發儀中濃縮至生藥濃度為1 g/mL。

1.3 試驗設計

在張家口某規?；B殖場的泌乳期為200 d左右的經產荷斯坦奶牛（2～4 胎） 中，根據奶牛群改良報告（DHI）篩選出牛奶體細胞數（SCC）大于50 萬個/mL（乳房和乳汁均無肉眼可見變化），且加利福尼亞乳腺炎試驗（CMT）檢測陽性的奶牛12 頭，隨機分為4 組，每組3個重復，每個重復1頭牛。乳房灌注劑低、中、高劑量組奶牛于每天擠奶并用酒精棉球消毒乳頭后，每個乳區分別灌注10、20、40 mL自制中藥乳房灌注劑，1次/d，連用7 d；陽性對照組奶牛的乳區在試驗期間每天灌注40 mL滅菌ddH2O。另選取6頭SCC小于20萬個/mL，且CMT 檢測陰性的奶牛，隨機分為2 組：正常對照組奶牛的乳區在試驗期間每天灌注40 mL滅菌ddH2O；藥物對照組奶牛的乳區每天灌注40 mL中藥乳房灌注劑。

1.4 樣品采集

1.4.1 牛奶樣品的采集和乳清的分離

最后一次乳房灌注24 h后，使用75%酒精消毒乳區，并用滅菌毛巾擦干，棄去前三把奶，每個乳區用滅菌離心管收集10 mL；4 ℃、16 000 ×g 離心30 min，棄去上層乳脂收集乳清。將每頭牛4個乳區分離到的乳清混合，獲得均質化樣品，-80 ℃保存。

1.4.2 奶牛乳腺組織樣品采集

參考文獻[10]方法采集乳腺組織，最后一次乳房灌注24 h后，各組奶牛乳房局部皮下用1%鹽酸普魯卡因浸潤麻醉，用一次性滅菌組織取樣活檢針（14G×15 cm）采集乳腺組織（50～100 mg/頭）。將每頭奶牛的乳腺組織樣品置凍存管中，液氮冷凍，-80 ℃保存。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 促炎細胞因子水平

取1.4.1中分離到的乳清樣品，按ELISA 試劑盒說明書操作檢測各組奶牛乳清中IL-1β、IL-8 和TNF-α含量。

1.5.2 炎癥信號通路相關蛋白表達

取奶牛乳腺組織（50 mg/頭），加入200 μL RIPA 組織裂解液，組織研磨儀勻漿后于4 ℃、12 000 ×g 離心5 min，取上清。按常規方法將蛋白樣品變性處理后進行SDS-PAGE（20 μg/孔）并轉移至PVDF 膜。PVDF 蛋白膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后置于稀釋（1∶1 000）的NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38、p-p38、細胞外調節激酶（ERK1/2）、p-ERK1/2、Jun N-端激酶（JNK1/2/3）、p-JNK1/2/3、NLRP3 和β-actin 抗體中4 ℃孵育過夜。各蛋白表達量用Li-COR Biosciences 系統成像，根據各Western blotting條帶光密度值（IOD）分析其表達量。

1.6 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 25.0 軟件采用單因素檢驗中的Tukey's檢驗進行分析。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 自擬中藥方對牛乳中SCC、IL-1β、TNF-α 含量的影響（見表1）

表1 自擬中藥方對牛乳中SCC、IL-1β、TNF-α含量的影響

由表1 可知，正常對照組和藥物對照組牛奶中SCC均低于20 萬個/mL，極顯著低于陽性對照組（P＜0.01）。經乳房灌注治療后，中劑量組牛乳SCC 顯著低于陽性對照組（P＜0.05），高劑量組則降至正常，表明該灌注劑對奶牛隱性乳腺炎療效確實。

與正常對照組及藥物對照組相比，患隱性乳腺炎奶牛乳清中IL-1β、TNF-α 含量均極顯著升高（P＜0.01）。高劑量中藥乳房灌注降低了促炎細胞因子含量，極顯著低于陽性對照組（P＜0.01）。結果表明，本研究制備的乳房灌注劑可抑制隱性乳腺炎病牛乳清中促炎因子含量。

2.2 自擬中藥方對乳腺組織中NF-κB和MAPK信號通路的影響（見表2）

表2 自擬中藥方對乳腺組織中NF-κB和MAPK信號通路的影響

由表2 可知，與正常對照組相比，患隱性乳腺炎奶牛的乳房組織中NF-κB p65和p38的磷酸化水平極顯著升高（P＜0.01），ERK 和JNK 的磷酸化水平極顯著升高（P＜0.01）。與陽性對照組相比，中、高劑量中藥乳房灌注劑治療后降低或恢復了上述蛋白的磷酸化水平，以高劑量組效果最好，但與正常對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。結果表明，中藥乳房灌注劑可抑制乳腺組織中NF-κB和MAPK信號通路的激活。

此外，NLRP3 的表達在炎癥反應中發揮關鍵作用。與正常對照組及藥物對照組相比，患隱性乳腺炎奶牛乳腺組織中NLRP3的表達極顯著增加（P＜0.01），而中藥乳房灌注劑治療可顯著抑制乳腺組織中NLRP3的表達。

3 討論

3.1 自擬中藥方的藥理作用及其對牛乳SCC的影響

奶牛乳腺炎尤其是隱性乳腺炎的發病率逐年升高，每年均會造成巨大的經濟損失?？股匾恢笔侵委熌膛Ｈ橄傺椎闹饕幬?，但存在藥物殘留、新的耐藥菌出現等副作用[11]。中藥具有不易產生耐藥性、無殘留或低殘留、毒副作用小等優勢[8]。已有研究表明，黃芪[12]、蒲公英[13]、金銀花[14]、瓜蔞[15]等具有抗菌消炎作用，可顯著改善奶牛乳腺炎臨床癥狀，增加產奶量，降低牛奶中SCC。本研究所用自擬中藥方中的主藥即為黃芪，具有益氣補虛作用；配合蒲公英、連翹、金銀花、紫花地丁、大青葉清熱解毒、消腫；輔以赤芍、瓜蔞、通草等活血散瘀、活絡通乳?，F代藥理學研究表明，雖然該方中藥物多具有免疫調節、抗菌、抗炎等作用，但其抗炎機制尚未明確。因此，在課題組前期試驗基礎上，本研究進一步證明了使用該自擬中藥方制備的乳房灌注劑顯著降低了牛乳中SCC，表明其具有治療奶牛隱性乳腺炎作用，并進一步探討了其對乳腺炎癥信號通路的調節作用。

3.2 自擬中藥方對乳清炎性細胞因子分泌的作用

TNF-α 和IL-1β 是典型的促炎細胞因子，介導炎癥反應[16-17]。Qiu等[18]報道，乳腺炎性細胞浸潤并分泌炎性細胞因子是乳腺炎主要的病理特征。但有研究表明，與臨床型乳腺炎不同，患隱性乳腺炎奶牛的血清中IL-1β、TNF-α 和IL-8 等促炎細胞因子含量和正常奶牛并無差異[19]，而在乳清中升高，且與隱性乳腺炎發病的嚴重程度呈正相關[20]。因此，本研究通過檢測奶牛乳清中TNF-α和IL-1β 的含量評估了中藥乳房灌注劑的抗炎作用，結果顯示，隱性乳腺炎陽性奶牛乳清中TNF-α 和IL-1β 含量升高，中藥灌注劑治療后其水平恢復正常，提示該乳房灌注劑可抑制乳腺組織炎癥反應。

3.3 自擬中藥方對隱性乳腺炎奶牛乳腺組織MAPK/NFκB和NLRP3信號通路的調節作用

NF-κB 是一種多亞基核轉錄因子，參與諸多免疫反應相關靶基因的轉錄調控，其中包括促炎細胞因子的基因[21]。此外，ERK、JNK 和p38 MAPK 家族亦參與調節細胞內的許多生理活動，在促炎細胞因子的分泌中發揮重要作用[22]。已有研究證實，革蘭氏陰性菌的內毒素可與Toll 樣受體4（TLR4）結合，激活NF-κB 和MAPK 信號通路，進而引起小鼠乳腺組織炎癥反應[23]。因此，本研究進一步探究了中藥乳房灌注劑對奶牛乳腺組織中NF-κB 和MAPK 信號通路的作用，結果表明，該中藥乳房灌注劑能夠有效降低病牛乳腺組織中NF-κB、ERK、JNK 和p38 MAPK 的磷酸化水平，提示其抗炎作用可能與這些信號通路有關。

炎癥小體可啟動組織對各種刺激的炎癥反應，NLRP3 炎癥小體是迄今發現的研究最廣泛的炎癥體，可激活休眠的Pro-Caspase-1蛋白水解為活化的Caspase-1，從而將細胞因子前體Pro-IL-1β和Pro-IL-18分別轉化為成熟的、具有生物活性的IL-1β和IL-18[24]。鑒于NLRP3在炎癥過程中的重要作用，本研究進一步探究了NLRP3在隱性乳腺炎病牛乳腺組織中的表達，結果表明，中藥乳房灌注劑顯著抑制了NLRP3的表達。

4 結論

本研究結果顯示，自擬中藥乳房灌注劑可能是通過抑制NF-κB、MAPK、NLRP3 信號通路抑制了促炎細胞因子的分泌，而且不影響健康奶牛乳中SCC 和乳清中IL-1β 和TNF-α 含量以及乳腺組織中上述炎癥信號通路相關蛋白表達，表明該灌注劑是一種潛在的治療奶牛隱性乳腺炎安全有效的藥物，但其確切有效成分及其作用機制尚有待進一步研究。