酵母鉻對熱應激綿羊肝臟組織基因表達的影響

楊改青 楊斯涵 梁本聰 王林楓* 付 彤 廉紅霞 張立陽 高騰云

（1．河南農業大學實驗室與設備管理辦公室，河南 鄭州 450046；2．河南農業大學動物科技學院，河南 鄭州 450046）

鉻是人和動物機體所必需的一種常見的微量元素，在調節內分泌、提高生產性能和胴體品質、增強動物的免疫反應、改善糖和礦物質代謝等方面具有一定的積極的作用[1]。三價鉻包括無機鉻（氧化鉻、氯化鉻）和有機鉻（蛋氨酸鉻、毗陡甲酸鉻、煙酸鉻和酵母鉻）[2]。酵母富含蛋白質、核酸、糖原、生物素、B 族維生素、膽固醇等多種活性物質，營養價值高[3]。酵母鉻是以酵母菌作為載體，通過一定的工藝與無機鉻培養基進行培養，通過生物轉化的方式將無機鉻同化在有機生物大分子上，進而轉化生物活性、吸收率低的無機鉻，使其更易被動物吸收的一類物質[4]。酵母鉻在參與畜禽營養代謝[5]、緩解動物應激反應、提高機體免疫力、降低脂肪沉積、增加不飽和脂肪酸含量[6]、改善繁殖性能[7]、提高胴體品質[8]、提高生產性能[9]等方面均具有一定作用。熱應激會影響畜體的抗氧化酶活性，使畜體產生免疫應答[10]。酵母鉻還可以增強胰島素與特定的受體和組織的結合，增強胰島素在蛋白質代謝、能量代謝、脂肪代謝、脂肪沉積和膽固醇中的作用[11]，通過調節體內的酸堿平衡達到提高畜體免疫力的目的。目前，有關酵母鉻對畜體作用的研究多集中于細胞的生長和繁殖，對肝臟作用的報道則較少。肝臟作為儲存活性鉻的器官，對畜體的鉻含量很敏感，因此需要探討日糧中酵母鉻對動物肝臟代謝、熱應激和免疫相關基因的表達的影響。本試驗對轉錄組測序數據進行初步的挖掘，為進一步揭示生物合成路徑及調控機制、關鍵酶基因功能研究等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼養管理

試驗于2018年7月8日—8月26日，在河南省洛陽龍須坡農牧有限公司養殖基地進行。預試期5 d，正式試驗期45 d。選擇5～6 月齡，體重相近、健康狀況良好的“杜×湖”雜交（杜泊公羊與湖羊母羊交配）綿羊14只，隨機分為對照組（基礎日糧，CTL組）、酵母鉻組（基礎日糧+0.5 mg/kg 酵母鉻，Cr 組），每組7 個重復，每個重復1 只羊。酵母鉻由河南某有限公司提供，鉻含量0.002 25%，蛋白質含量47.6%，水分含量4.2%，粗灰分含量6.4%。參照NRC（2007）[12]飼養標準配制日糧，基礎日糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養水平（干物質基礎）

對圈舍進行統一打掃并進行消毒，羊進行統一驅蟲，試驗期間測定圈舍內溫濕度[7]。各組羊分圈飼喂，每天7：00、16：30各飼喂一次。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 熱應激的判斷與評價

熱應激程度用溫濕度指數（THI）衡量。

式中：T為溫度（℃）；RH為相對濕度（%）。

1.2.2 生長性能

預飼期連續3 d對空腹狀態的羊進行稱重，試驗結束再次進行稱重，計算每只羊的平均日增重、平均日采食量、料重比。

1.2.3 屠宰性能

飼養試驗結束后，試驗動物24 h 禁食，12 h 禁水，稱重后進行屠宰，計算胴體重、屠宰率等屠宰指標。

1.3 肝臟組織轉錄組

1.3.1 組織樣品采集

屠宰后，從每組選取4 個樣品用作轉錄組測序的綿羊肝臟組織樣品，于-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于RNA的提取。

1.3.2 測序樣品的RNA提取、文庫構建及文庫檢測

提取肝臟組織樣品的RNA，通過Nanodrop檢測RNA純度（OD260/280nm、OD260/230nm），通過Agilent 2100對RNA片段長度進行檢測。文庫質檢合格后，按照根據文庫有效濃度及測序讀長進行測序。RNA-Seq 文庫構建和測序利用Illumina二代高通量測序平臺進行測序。

1.3.3 數據過濾、組裝及差異表達分析

為保證數據分析的質量，需要過濾去除2 個樣本的原始序列中包含的接頭或者低質量序列。處理以后獲得的高質量數據選擇Tophat2軟件進行參考基因的比對?；赪allenius non-central超幾何分布，采用GO seq軟件進行GO（gene ontology）富集分析。以KEGG 數據庫中Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個轉錄組背景相比，在差異表達基因中顯著性富集的Pathway。

1.3.4 實時熒光定量PCR驗證

提取6 個樣品的總RNA，反轉錄為cDNA，根據SYBR Premix EX TaqTM試劑盒說明書進行熒光定量PCR 驗證，以GAPDH為內參基因，實時熒光定量PCR 引物設計見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物設計

采用2-△△Ct法計算各基因的表達量，對8個隨機選擇的差異基因進行實時熒光定量PCR驗證，與RNA-Seq測序結果相比較，檢測RNA-Seq測序數據是否可靠。挑選與熱應激、免疫相關的3 個差異基因，通過RT-qPCR 檢測基因的相對表達量。

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用Excel 進行初步整理，SPSS 24.0 軟件進行分析。結果以“平均值±標準誤”表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 試驗期間THI變化情況（見圖1）

圖1 試驗期間THI變化情況

由圖1 可知，整個試驗過程中THI 均大于72（最低74，最高85），表明試驗羊處于熱應激狀態。

2.2 酵母鉻對綿羊生長性能的影響（見表3）

表3 酵母鉻對綿羊生長性能的影響

由表3 可知，試驗結束時，Cr 組綿羊末重較CTL 組增加了5.06%（P＞0.05）。Cr組綿羊平均日增重與CTL 組相比有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）。Cr組綿羊平均日采食量與CTL組相比有所增加（P＞0.05）。

2.3 酵母鉻對綿羊屠宰性能的影響（見表4）

表4 酵母鉻對綿羊屠宰性能的影響

由表4 可知，Cr 組綿羊宰前活重、大網膜重、腎周脂肪重、屠宰率與CTL 組之間均差異不顯著（P＞0.05），Cr組胴體重顯著高于CTL組（P＜0.05）。

2.4 肝臟組織測序數據過濾

測序產生的原始數據通常會帶有少量接頭污染及較低質量的讀長片段，通過過濾原始數據從而得到干凈的序列，以免對后續數據分析造成影響。8個樣品的測序數據統計結果見表5。由表5 可知，Q20、Q30 含量均在90%以上，說明測序數據良好，可滿足后續數據分析。

表5 8個樣品的測序數據統計結果

2.5 肝臟組織差異表達基因篩選（見圖2）

圖2 差異基因火山圖

顯著性差異表達基因的篩選標準為log2倍性變化≥2和P＜0.05。由圖2可知，試驗共篩選出821個差異表達基因，340個基因表達量上調，481個基因表達量下調。

2.6 差異基因的GO分析（見圖3）

圖3 差異表達基因GO富集分析

按照GO 功能分類，將GO 注釋分為3 大類，分別為生化過程、細胞組分和分子功能。由圖3 可知，本試驗結果主要集中在生化過程。

2.7 基因的KEGG功能分類

對差異基因進行KEGG 分析，前20 個顯著富集的通路見圖4。由圖4可知，差異基因主要富集在系統性紅斑狼瘡、吞噬體等通路。

圖4 差異表達基因KEGG富集分析

2.8 差異表達基因實時熒光定量PCR驗證（見圖5）

圖5 差異表達基因的實時熒光定量PCR驗證

通過對差異表達基因進行篩選、功能注釋及富集分析后，從中篩選出8 個差異表達基因，分別是C4BPA、HSD17B6、GRIA1、ZEP42、KCNT2、TNFRSF9、TMED2、ELAVL2。以GAPDH為內參基因，對上述8個差異表達基因進行RNA-Seq驗證。定量結果顯示，差異表達基因的表達趨勢與測序結果一致，表明轉錄組測序技術在篩選差異表達基因上較為可靠。

2.9 酵母鉻對綿羊免疫、熱應激相關因子基因表達的影響（見圖6）

圖6 差異基因的實時熒光定量PCR結果

由圖6可知，與CTL組相比，Cr組CD80表達量有所增加，但差異不顯著（P＞0.05）。Cr 組CD86 顯著低于CTL組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 酵母鉻對綿羊生長性能的影響

當動物產生應激時，機體會產生大量的葡萄糖代謝產物，以對抗應激；而血糖的升高會導致鉻的動員量升高，被調動的鉻無法再被吸收，隨著尿排出體外，即給予高強度的鉻可以提高動物的抗性[13]。Cr3+是葡萄糖耐受因子，在飼糧中加入鉻復合物可使胰島素與受體細胞膜結合，從而增強糖代謝通路的酶活力，減少糖異生通路的酶活力，提高機體對葡萄糖的吸收和利用；提高機體對胰島素的敏感度，參與蛋白合成，促進肌肉生長，提高其生長能力[14]。本試驗結果顯示，與CTL 組相比，添加0.5 mg 的酵母鉻對綿羊的增重無顯著影響，是否與CTL添加劑量或添加方式相關還有待探究。

3.2 酵母鉻對綿羊屠宰性能的影響

飼料補充方式、飼喂方式、綿羊的日齡、宰前活重、膘情等均是影響屠宰效果的重要因素，提高屠宰日齡、屠宰前活重對屠宰率有顯著影響。臟器的重量是評價動物身體功能的一個重要指標[15]。本試驗中，Cr 組綿羊胴體重顯著高于CTL 組，表明酵母鉻對綿羊生長具有一定促進作用；Cr組屠宰率與CTL組相比差異不大，可能是由于試驗組內臟器官的重量較大，導致各組屠宰率無顯著差異。

3.3 酵母鉻對綿羊肝臟差異表達基因的影響

肝臟作為動物體的重要器官，動物的生長發育、物質代謝均與肝臟代謝途徑相關[16]。動物產生應激后體溫調節能力會遭到破壞，機體的免疫力下降[17]，肝臟作為新陳代謝的器官，其解毒能力也會存在下降情況[18]。

RNA-Seq 也被稱為轉錄組測序，是近年來逐步發展的新一代轉錄分析技術。本試驗以綿羊肝臟組織為研究對象進行轉錄組測序分析，獲得原始測序數據在8 000萬以上，序列比對率均在80%以上，且Q30也在90%以上，堿基識別準確率高。以log2倍性變化≥2 和P＜0.05 為標準，篩選出包括340個上調和481個下調表達的基因。通過對差異表達基因進行篩選、功能注釋及富集分析，選取8 個差異表達基因進行實時熒光定量PCR 驗證，結果與RNA-Seq結果趨勢一致，表明了轉錄組測序技術在差異表達基因方面的準確性及可靠性。

免疫球蛋白超家族成員CD80、CD86 作為T 淋巴細胞中重要的共刺激分子，在抗原遞呈細胞（APC）表面表達，與相應配體進行結合并誘導T 淋巴細胞發揮其功能。細胞因子IL-4、IL-12、LPS等對CD80、CD86的表達起一定的調節作用[19]。CD80 在接受抗原刺激2～3 d 后表達量上調，而CD86在接受刺激之后可迅速上調[20]。細胞因子的分泌主要是通過與免疫細胞表面的相應受體與CD80、CD86 結合，進行調節發揮相應的作用[21]。本試驗中，Cr 組CD80 在肝臟中表達量上調，肝臟作為補體合成的重要器官，這可能是機體自身的一種保護機制，對肝臟起到一定的保護作用。CD80、CD86 可對以T 淋巴細胞免疫為主的自身免疫性疾病起到一定的調節作用；本研究結果表明，酵母鉻能夠通過促進CD80、抑制CD86 進而對T 細胞產生調節作用[22]。HSP70 是熱休克蛋白中的一類應急表達的分子伴侶蛋白[23]。HSPA1A不僅是HAP70 家族中的一類誘導型表達基因[24]，也是目前HSP70 家族中研究最多的一種熱休克蛋白[25]。HSPA1A是熱休克蛋白中最為保守的一種，在各種應激條件下均會大量表達[26]。本試驗中，與CTL 組相比，Cr 組肝臟組織的HSPA1AmRNA表達量有所增加，表明Cr可提高動物對熱應激的適應能力。

4 結論

本試驗結果表明，日糧中添加適量酵母鉻可改善綿羊的屠宰性能。酵母鉻通過上調CD80，抑制CD86 進而對T 細胞產生免疫調節作用，能夠提高機體對熱應激的適應能力，保護綿羊肝臟免受損傷。