基于全基因組重測序篩選南陽黑豬脂肪沉積相關候選基因

李 盼 普布占堆 張 浩 魯云風 張 博*

(1.中國農業大學 動物科學技術學院,北京 100193; 2.南陽師范學院 生命科學與技術學院,河南 南陽 473061)

豬肉是我國主要的肉類消費品,豬肉的肌內脂肪含量高低已成為消費者挑選豬肉的重要考慮因素[1]。在豬生產中,脂肪沉積是一個復雜而重要的經濟性狀,其中背膘厚度是衡量脂肪沉積的良好指標,多項研究表明它與生長速率、肉質和繁殖性能呈顯著相關[2-4]。肌內脂肪含量也可以影響其他肉質性狀,如肉的風味、嫩度、剪切力、大理石紋評分、系水力等,在豬的育種工作中具有不可替代的重要地位[5]。目前,大量研究利用現代分子育種技術探討肌內脂肪沉積和基因之間的關系,發現瘦素基因[6]、脂肪酸結合蛋白基因家族[7]和脂肪細胞分化決定因子等與脂質生成密切相關[8]。

南陽黑豬是分布于河南省南陽地區西部一帶的優良地方品種,具有我國地方豬種的共有特性,如脂肪沉積多、生長速度較快、繁殖性能好和抗病性強等,并且受到的人工選育較少,群體內脂肪沉積性狀的表型差異較大[9-10]。研究表明南陽黑豬的礦物質含量、大理石條紋、肉色和肌內脂肪含量均顯著高于商品豬[11-13]。因此,南陽黑豬是研究脂質沉積的理想模型。魯云風等[14-16]經育種實踐發現南陽黑豬種群中同胞個體間存在背膘厚等脂肪表型分化的現象,并對脂肪酸相關指標差異極顯著的個體進行了轉錄組分析,鑒定了與脂肪酸代謝相關的候選基因。苗志國等[17]發現南陽黑豬與長白豬相比具有較低的激素敏感脂肪酶(HSL)活性,而脂肪酸合成酶(FAS)、肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ(CPT-Ⅰ)和脂蛋白脂酶(LPL)活性及FAS/HSL比值則顯著性高于長白豬,表明南陽黑豬優良肉品質的形成與脂肪代謝相關酶活性間存在重要相關性。此外,Wang等[18]分別對脂肪表型差異明顯的南陽黑豬進行了轉錄組和蛋白組學分析,鑒定到多個關鍵脂肪沉積候選基因和蛋白。

由于肌內脂肪形成的復雜性,現有研究仍不足以闡釋肌內脂肪形成的具體機制。隨著生物信息學和測序技術的快速發展,全基因組重測序已成功用于檢測一些人類疾病的因果變異[19],也應用于動物遺傳機制研究[20]。采用全基因組重測序技術可以在全基因組范圍內篩選到大量的SNPs、InDels、SVs和CNVs等,這些變異可能是導致動物遺傳進化變異的主要決定因素,對動物遺傳進化分析及分子輔助育種研究具有重要的作用[21-23]。此外,遺傳變異會引起動物表型差異,挖掘潛在的基因組變異信息對揭示動物個體間的表型差異和動物的遺傳改良具有重要意義。然而,目前對南陽黑豬在全基因組水平上的進一步研究卻鮮少報道。

本研究通過對南陽黑豬種群不同個體脂肪表型(胴體性狀和肉質性狀)統計分析,篩選出背膘厚度差異顯著的同胞或半同胞個體,利用高通量測序技術對豬背最長肌進行全基因組重測序,深度挖掘兩組間存在的SNP、InDel、SV和CNV 4種變異位點,并通過生物信息學分析明確影響脂肪沉積的功能基因,為進一步推進南陽黑豬分子育種改良工作提供理論支持和數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣本信息與Wang等[18]轉錄組測序樣本相同,所用試驗群體均來自河南省南陽市內鄉南陽黑豬場,選擇體重相近、胎次相同和飼養條件相同的3組(6頭)全同胞或半同胞南陽黑豬,每組同胞個體間脂肪表型差異較大。生長至190日齡時對此6頭豬進行屠宰,并根據系譜信息和測定標準統計胴體性狀和肉質性狀表型數據。取其背最長肌中段最后肋與第一腰椎間肌肉組織測定肉品質指標,其余樣品利用DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組DNA,Nanodrop 2000(美國)檢測DNA的純度(OD260/OD280),檢測合格后-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 測定指標及方法

1.2.1胴體性狀

南陽黑豬屠宰操作規程參照《瘦肉型豬胴體性狀測定技術規范》(NY/T 825—2004)。測定指標包括宰前活體重、胴體直長、胴體斜長、胴體重、背膘厚度、肋骨數、屠宰率和眼肌面積。

1.2.2肉質性狀

根據《豬肌肉品質測定技術規范》(NY/T 821—2004)所述方法測定肉品質,測定指標包括肌內脂肪含量、肉色、剪切力、pH45 min、pH24 h、大理石紋、48 h滴水損失和蒸煮損失。

1.3 全基因組重測序

1.3.1建庫測序

把檢測合格的DNA樣品利用超聲波隨機打斷,DNA片段經末端修復、加測序接頭、純化和PCR擴增完成整個文庫制備。最后,對質檢合格的文庫通過Illumina HiSeq 4000測序。

1.3.2測序數據的質量控制、注釋和多態位點檢測

對測序得到的原始測序reads進行數據質控,對接頭序列及polyN、polyA等序列過濾,然后使用BWA(v0.7.16)軟件[24]將質控后的reads與豬參考基因組(Sscrofa11.1)序列進行比對。

其次,通過變異檢測軟件GATK[25]檢測全基因組范圍內SNP和Indel位點,通過染色體結構變異分析軟件DELLY[26]檢測全基因組范圍內SV位點,通過拷貝數變異分析軟件Control-FREEC[27]檢測全基因組范圍內CNV位點,再根據質量值、深度、重復性等因素做進一步的過濾篩選,最終得到高可信度的SNP、Indel、SV和CNV數據集,并采用ANNOVAR[28]軟件對其進行注釋。

此外,將檢測到的SNP、Indel、SV和CNV進行功能注釋,再用vcftool(v 0.1.16)軟件計算差異變異位點,并對所得到的差異基因進行GO(http:∥geneontology.org/)和KEGG(https:∥www.kegg.jp/)富集分析。

1.4 數據統計與分析

數據使用Excel 2016進行整理,使用SPSS 23.0軟件進行統計樣本t檢驗,結果以“平均值±標準差”表示。P<0.01表示差異極顯著,P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 南陽黑豬高-低脂肪組肌肉品質分析

基于Wang等[18]對南陽黑豬脂肪相關表型的測定結果進行高-低脂肪組的選擇,分別從高-低脂肪組選取3頭用于后續全基因組重測序分析并對其胴體性狀和肉質性狀表型數據進行統計。如表1所示,胴體性狀中高脂肪組的肌內脂肪含量((4.96±0.62)%)顯著高于低脂肪組((3.61±0.11)%)(P<0.05),平均背膘厚((43.74±2.33) mm)極顯著高于低脂肪組((28.36±4.17) mm)(P<0.01),其余各項指標在兩組之間數值相近無顯著差異(P>0.05)。在肉質性狀測定結果中,在高-低脂肪組之間背最長肌剪切力存在極顯著差異(P<0.01),其中剪切力、pH45 min、蒸煮損失和48 h滴水損失在兩組之間存在顯著差異(P<0.05),其余各項指標在兩組之間無顯著差異。

表1 南陽黑豬胴體和肉質指標分析

2.2 南陽黑豬高-低脂肪組全基因組重測序數據分析

南陽黑豬高脂肪組和低脂肪組全基因組重測序原始數據已提交到基因表達綜合數據庫(PRJNA894135),共產生213.25 Gb數據,過濾后得到208.00 Gb有效數據,平均有效率為97.56%,Q30均在93.07%以上,與豬參考基因組(Sscrofa11.1)比對后的比對率達到97.81%以上(表2),表明本次試驗獲得的序列能夠在染色體中均勻分布、隨機性好、數據質量較高,可以用于后續突變檢測及相關分析。

表2 南陽黑豬高-低脂肪組測序信息

2.3 南陽黑豬高-低脂肪組SNP位點變異檢測及注釋

根據與參考基因組的比對結果,在南陽黑豬高脂肪組和低脂肪組的基因組上找到大量的遺傳變異。在高脂肪組和低脂肪組2個組間分別檢測得到12 662 411和13 164 680個SNPs,其中轉換類型的SNP數量最多,在兩組的雜合率分別為66.92%和63.73%。通過對南陽黑豬高脂肪組和低脂肪組進行SNP注釋,經過分析發現兩組的SNP變異主要集中在基因間區,比例分別為58.16%和58.19%,其次為內含子區域,比例分別為37.38%和37.43%,而發生在基因的剪切位點的SNP最少,只有497和524個。除此之外,南陽黑豬高脂肪組和低脂肪組發生在蛋白編碼區內的SNP位點數量分別為87 176和91 225,其中同義突變比例分別為60.52%和60.31%,非同義突變比例分別為38.79%和39.01%(表3)。

表3 南陽黑豬高-低脂肪組中基因SNP變異位點分布統計

2.4 南陽黑豬高-低脂肪組InDel變異檢測及注釋

通過對南陽黑豬高脂肪組和低脂肪組進行InDel變異檢測,在2個組間分別檢測得到2 873 762和2 929 060個InDels,經分析發現2組的InDel變異分布區域與SNP結果類似,主要集中在基因間區和內含子區域,在基因間區的比例分別為58.02%和57.94%,在內含子區域的比例分別為37.96%和38.06%。另外,南陽黑豬高脂肪組和低脂肪組在蛋白編碼區共檢測到4 773和4 896個InDels,其中移碼插入的占比最多,比例分別為63.75%和63.34%,而移碼缺失的比例分別為18.06%和18.12%(表4)。InDel長度的不同會對基因組造成不同程度的影響。如圖1所示,在全基因組水平上或者在外顯子區內,不同長度的InDel的分布有著明顯的差異,其突變模式主要以1個堿基的InDel為主。

圖1 全基因組(a)和外顯子區(b)InDels長度分布

2.5 南陽黑豬高-低脂肪組SV變異檢測及注釋

SV變異主要包括缺失(Deletion, DEL)、易位(Translocation,TRA)、重復(Duplication,DUP)、倒位(Inversion, INV)、插入(Insertion, INS)。在2組中分別檢測到26 670和29 688個SVs,5種變異類型中DEL數量最多,分別為18 063和20 187個,分別占總SV變異數的67.73%和68.00%。其次是INS,分別為5 684和6 474個,分別占總SV變異數的21.31%和21.81%,而SV變異類型TRA、DUP和INV的占比較少。因此,南陽黑豬高-低脂肪組SV變異主要發生的變異類型為DEL和INS。此外,對SV變異位點進行注釋,發現SV的分布區域也主要集中在基因間區和內含子區域,兩組在基因間區的比例分別為54.54%和54.53%,在內含子區的比例分別為34.39%和34.96%(表5)。

表5 南陽黑豬高-低脂肪組中基因SV變異位點在全基因組的分布統計

2.6 南陽黑豬高-低脂肪組CNV變異檢測及注釋

CNV變異的變異類型包括缺失CNV和重復CNV。在兩組中分別檢測到910和989個CNVs,缺失CNV數和重復類型的CNV數比例相近,分別約占總CNV數的一半。對南陽黑豬高脂肪組和低脂肪組中基因CNV變異位點注釋結果顯示,發現CNV的分布區域主要集中在基因間區和外顯子區域,兩組在基因間區的比例分別為42.86%和43.88%,在外顯子區的比例分別為45.38%和43.68%(表6)。

表6 南陽黑豬高-低脂肪組中基因CNV變異位點分布統計

2.7 關鍵變異基因的功能分析

通過與豬參考基因組比對,篩選高-低脂肪組中存在SNP非同義突變和 InDel移碼突變的基因,從而確定兩組中可能存在差異表達且影響功能的基因。通過生物信息學分析,兩組之間共注釋到有功能注釋的組間差異基因209個。GO分析結果表明這些基因在生物學過程(BP)中主要富集在肽基-絲氨酸的磷酸化(Peptidyl-serine phosphorylation)、RNA聚合酶啟動子的調控(RNA polymerase II promoter)、核糖體組裝(Nucleosome assembly)等,細胞組分(CC)主要富集在高爾基體(Golgi apparatus)和突觸前部(Presynapse)。分子功能(MF)主要富集在DNA糖基化酶活性(DNA glycosylase activity)、WW結構域的結合(WW domain binding)、DNA酶的活性(DNAlyase activity)、ATP酶的活性(ATPase activity)和蛋白酶的活性(Protein kinase activity)等(圖2(a));KEGG分析表明這些基因主要集中在mTOR信號通路(mTOR signaling pathway),甲狀腺信號通路(Thyroid hormone signaling pathway),神經營養蛋白分子信號通路(Neurotrophin signaling pathway)以及ABC 轉運蛋白信號通路(ABC transporters)等(圖2(b))。

圖2 南陽黑豬高-低脂肪組間變異基因GO(a)和KEGG(b)注釋分類圖

2.8 南陽黑豬轉錄組和重測序聯合分析

利用Wang等[18]轉錄組測序結果(樣本來源與數量與該研究相同)與本研究基因組重測序結果進行聯合分析,480個轉錄組差異基因與209個重測序差異基因共交集到8個基因(圖3),包括CTNNA3、FASTKD1、HAT1、COMMD4、PLP1、CREB5、NHSL2和ITGA6,其中2個基因(PLP1和ITGA6)涉及脂肪細胞分化,具體功能信息如表7所示。

圖3 南陽黑豬高-低脂肪組轉錄組和 重測序組間差異基因韋恩圖

表7 南陽黑豬高-低脂肪組轉錄組和重測序組間關鍵變異基因功能注釋結果

3 討 論

南陽黑豬作為我國優良地方豬種,以高脂肪沉積和高遺傳分化而聞名,是研究我國地方豬脂肪沉積相關遺傳機制的良好研究材料[17]。在本研究中,為分析影響南陽黑豬群體內脂肪表型分化的關鍵基因,以Wang等[18]測定的肌內脂肪含量作為核心選擇指標,并對其進行胴體性狀和肉質性狀的統計分析。胴體性狀作為豬肉用性能的重要指標,直接影響著經濟效益。與引進品種豬相比,地方豬種具有獨特的種質特性,如松遼黑豬[29]、豫西黑豬[30]和關中黑豬[31]等地方豬種的背膘厚均高于引進品種豬。本研究顯示在高-低脂肪組之間的宰前活重、胴體重、眼肌面積和屠宰率等指標無顯著差異的情況下,高脂肪組平均背膘厚呈明顯升高的趨勢,進一步證實了南陽黑豬群體脂肪相關表型變異較大的特點[32]。肌肉的嫩度、多汁性、適口性等肉質性狀與肌內脂肪含量呈顯著正相關[33]。Kim等[34]研究發現肌內脂肪含量的增加有利于提高pH24 h和減少滴水損失,其他相關研究也發現肌內脂肪含量與大理石紋評分和pH45 min呈正相關,與滴水損失和蒸煮損失呈負相關[35-36]。本研究表明,高脂肪組的剪切力極顯著低于低脂肪組(P<0.01),這與先前報道的肌內脂肪含量越高,則肉質剪切力越弱相一致[37]。高脂肪組的48 h滴水損失和蒸煮損失均顯著低于低脂肪組(P<0.05),高脂肪組的pH45 min高于低脂肪組,說明南陽黑豬高脂肪組肉質優于低脂肪組。除剪切力、水分含量和pH45 min外,高脂肪組與低脂肪組間其他品質沒有顯著差異,側面印證了本研究對南陽黑豬高脂肪組和低脂肪組分組的可靠性,保證了高-低脂肪組之間基因多態性主要與脂肪沉積相關,能在一定水平上反映南陽黑豬高-低脂肪組在基因組水平上的差異。

越來越多研究發現全基因組重測序可鑒定出與動物個體生產性狀密切相關的變異位點,這些關鍵變異位點對動物生產及分子育種均具有重要意義[38-39]。本研究中通過全基因組重測序挖掘影響南陽黑豬脂肪沉積的功能基因和變異位點,結果顯示,高-低脂肪組與參考基因組之間均發生SNP、InDel、SV和CNV4種類型的變異,共檢測到2 827 091個SNPs、5 802 822個InDels、56 358個SVs及1 898個CNVs,但4種遺傳變異在基因組上的位置和數目差異并不顯著。低脂肪組獲得的SNP、InDel、SV和CNV,僅為高脂肪組的1.040倍、1.019倍、1.113倍和1.086倍,這說明高-低脂肪組間遺傳背景相似,引起南陽黑豬同胞脂肪沉積能力不同的原因可能是由一小部分基因所調控的。另外,所檢測到的SNP數量明顯多于其他類型變異的數量,這說明南陽黑豬種群的基因變異主要以SNP變異為主。在SNP變異中,高-低脂肪組的轉換/顛換比例分別為2.62和2.55,這說明在南陽黑豬種群中同種類型堿基置換的突變模式比不同類型間更容易發生。多項研究表明SNP、InDel和SV大多發生在基因內部甚至是外顯子區域、啟動子區域等重要位置,這種變異往往能夠引起基因功能發生重大變化[40-41]。在本研究中,分別對南陽黑豬高-低脂肪組的變異位點進行注釋,發現SNP、InDel和SV主要分布在基因間區和基因內的內含子區,而CNV主要分布在基因間區和基因內的外顯子區,本研究變異位點分布特點與邢凱[42]對松遼黑豬重測序結果相似。一般情況下,移碼突變和錯義突變會影響基因的功能和表達,甚至會直接影響到動物的表型性狀。通過生物信息學分析,本研究共發現有功能注釋的組間差異基因209個,然后通過GO和KEGG分析進一步探索了脂肪沉積相關的基因及其參與途徑。進一步整合Wang等[18]轉錄組數據,最終鑒定出2個與脂肪沉積相關的差異基因(PLP1和ITGA6),這些基因的多態性變化可能是影響南陽黑豬脂肪沉積的關鍵。蛋白脂蛋白(Proteolipid protein 1,PLP1)基因是中樞神經系統的主要髓磷脂蛋白,它在髓鞘多層脂蛋白的形成和維持中起著至關重要的作用[43]。整合素α6 (Integrin subunit alpha 6,ITGA6)基因主要參與到PI3K-Akt信號通路,局灶性粘附,ECM受體相互作用,細胞粘附分子和棕色脂肪細胞分化等通路中,有報道顯示ITGA6是血小板上層粘連蛋白的受體,參與精卵融合和胚胎發育相關信號傳導,還可通過連接細胞骨架和細胞內的各種信號分子介導細胞外基質相互作用[44],推測ITGA6基因可能參與肌肉發育和脂肪沉積等途徑。目前國內外關于這些基因在脂肪沉積中的具體分子作用機制尚不清楚,有必要進一步探究這些基因在豬脂肪沉積中的具體調控作用。

4 結 論

本研究通過比較南陽黑豬高脂肪組和低脂肪組胴體性狀和肉質性狀,發現兩組之間呈顯著差異的性狀主要與脂肪相關,如肌內脂肪含量、平均背膘厚、剪切力、pH45 min和水分含量,其他肉品質性狀在兩組中沒有顯著差異。全基因組重測序共篩選到有功能注釋的組間差異基因209個,主要參與2個細胞組成部位,6 類分子功能和5個生物學過程。整合前期課題組南陽黑豬高-低脂肪組轉錄組數據,共交集到8個差異基因,其中PLP1和ITGA6與脂肪沉積相關。本研究將為后續南陽黑豬的脂肪沉積相關的育種研究工作奠定了堅實的基礎。