蕓薹屬植物細胞質特異分子標記的開發

于海波,張東鎖,高連亮,董 慧,郭 媛,胡勝武

(西北農林科技大學 農學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室,陜西楊凌 712100)

十字花科蕓薹屬包含許多重要的油料、蔬菜和飼用植物[1]。該屬植物包含6個重要的栽培種,其中3個二倍體基本種白菜(BrassicarapaL.)、甘藍(B.oleracea)、黑芥(B.nigra),以及這3個二倍體之間相互兩兩雜交后染色體加倍得到的3個四倍體復合種,甘藍型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.juncea)、埃塞俄比亞芥(B.carinata),它們之間的遺傳關系可以用著名的禹氏三角來表示。

植物遺傳信息由細胞核和細胞質基因組(線粒體、葉綠體基因組)組成,線粒體基因與細胞核基因之間相互交流,影響植物一些重要性狀的表達,例如雄性不育、抗病性、種子發育等[2-4]。目前,蕓薹屬禹氏三角的6個栽培種甘藍型油菜[5]、芥菜型油菜[6]、埃塞俄比亞芥[6]、白菜[6-7]、甘藍[6,8]、黑芥[9]的線粒體DNA已完成測序。而且,蕓薹屬植物中一些重要的細胞質雄性不育材料,例如polCMS[10],hauCMS[11],oguCMS[12]以及BVRC-CMS96[13]的線粒體DNA也成功測序?；诰€粒體DNA基因組上的細胞質雄性不育相關基因序列或者染色體結構變異(例如InDel、SSR等),前人開發出了鑒定細胞質類型的分子標記,并對甘藍型油菜[14-15]、白菜型油菜[16]、芥菜型油菜[17]的細胞質類型(線粒體類型)進行了鑒定。研究結果表明,甘藍型油菜、芥菜型油菜、甘藍細胞質存在豐富的種間[18-19],或者種內多樣性[14,20-21]。梁龍兵等[19]利用線粒體及葉綠體特異SSR標記,對甘藍型油菜等6個蕓薹屬栽培種進行了分析,發現5對特異性引物能較好地鑒別蕓薹屬栽培種。

蕓薹屬植物細胞質多樣性的研究,對其起源進化和遺傳育種具有非常重要的意義。因此,本研究利用33份蕓薹屬植物材料,其中20份甘藍型油菜、2份芥菜型油菜、2份埃塞俄比亞芥、3份甘藍、2份白菜、2份黑芥,以及1份蕓芥和1份板藍根作為對照,利用文獻報道的細胞質分子標記對參試材料進行鑒定,結果發現前人報道的引物具有新的利用價值。研究結果將對蕓薹屬植物種質資源的保護、挖掘與育種利用具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材 料

參試材料為33份蕓薹屬植物材料,其中包括20份甘藍型油菜(B.napus)、2份芥菜型油菜(B.juncea)、2份埃塞俄比亞芥(B.carinata)、3份甘藍(B.oleracea)、2份白菜(B.rapa)、2份黑芥(B.nigra),以及1份蕓芥(Erucasativa)和 1份板藍根(Isatisindigotica)作為對照(表1)。上述材料均由西北農林科技大學油菜研究中心提供,于2020年9月下旬種植于西北農林科技大學曹新莊試驗地(N 34.30°,E 108.10°),常規田間管理。

表1 供試材料信息

本研究所用引物及信息見表2,來源于前人文獻報道[9,14,17,22]。上述引物均由擎科試劑公司(西安,中國)進行合成,ddH2O稀釋至工作液(10 μmol/L),4 ℃保存,備用。

表2 引物信息

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 每份材料于幼苗期(2～3葉)隨機選取15株,采取整株幼嫩葉片混樣0.3 g,利用改良的CTAB法[23]進行總DNA的提取。DNA沉淀用50 μL ddH2O溶解,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA質量,并用分光光度計(BioTek Instruments,美國)檢測濃度,用ddH2O稀釋至40 ng/μL的工作濃度。

1.2.2 PCR反應體系及產物的檢測 參試材料細胞質類型鑒定的一步多重PCR方法如Zhao等[14]的報道。Indel-F/R、rsp3F/R-1和mtSSR2-F/R引物PCR反應體系均為20 μL,其中包括40 ng/μL DNA模板1.5 μL,2× Es Taq PCR Mix 10 mL(康為,北京),正向、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL,6.9 μL ddH2O,擴增程序參照Shu等[22]的報道。

PCR反應結束后,取5 μL擴增產物進行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在120～140 V電壓下電泳30～40 min,電泳結果用凝膠成像系統(勤翔,中國)觀察并拍照記錄。

1.2.3 DNA膠回收測序及序列比對 根據DNA膠回收試劑盒(全式金,北京)說明書步驟進行PCR擴增產物回收,由擎科試劑公司(西安)完成測序,測序結果使用DNAMAN 8.0軟件比對分析。

2 結果與分析

2.1 參試材料的一步多重PCR擴增結果

利用Zhao等[14]發明的一步多重PCR方法,對參試材料進行擴增鑒定。結果(圖1)表明,在20份甘藍型油菜中,有10份材料為nap細胞質類型,6份為pol類型,4份為cam類型。2份芥菜型油菜為cam類型,2份白菜為cam類型。該方法還在參試其他材料中也擴增出特異的條帶類型,在甘藍材料中擴增出500 bp和1 000 bp左右的特異帶型,將其命名為Bol-type;在2份黑芥材料中擴增出了2種不同的帶型,分別命名為Bni-typeⅠ和Bni-typeⅡ,在2份埃塞俄比亞芥材料中,擴增出的帶型與Bni-typeⅠ相似;在1份板藍根中擴增的帶型與Bni-typeⅠ相似,命名為Bni-typelike;在蕓芥中擴增出750 bp和 1 200 bp左右的特異帶型,將其命名為Esa-type(圖1,表1)。

M表示Marker,nap,pol,ogu, IP-ogu和cam分別表示nap,pol,ogu,IP-ogu和cam細胞質材料,編號1～33代表的材料信息同 表1

2.2 Indel-F/R引物擴增結果

利用Indel-F/R標記[18]對參試植物材料進行PCR擴增。結果(圖2)表明,在17份參試材料中擴增出3種不同大小的片段(分別是251 bp,282 bp和344 bp)。在2份芥菜型油菜材料中,一份材料(No.2)擴增出282 bp條帶,而另一份材料(No.3)擴增出251 bp條帶;在3份甘藍材料中擴增出282 bp條帶;在2份白菜、2份埃塞俄比亞芥、2份黑芥、1份蕓芥和1份板藍根材料中均擴增出251 bp條帶。在4份甘藍型油菜材料中,有1份pol細胞質類型材料(No.4)和1份cam細胞質類型材料(No.7)中擴增出251 bp條帶,而2份nap細胞質材料(No.5,No.6)卻擴增出344 bp條帶(圖2,表1)。

M.Marker;編號1～17.材料信息同表1

再利用該引物對16份不同細胞質類型的甘藍型油菜,其中有8份nap材料,5份pol材料和3份cam材料(圖3,表1),進行PCR擴增。結果表明,在參試8份nap材料(No.18～25)中均擴增出344 bp條帶,而在3份cam材料(No.26～28)和5份pol材料(No.29～33)中均擴增出251 bp條帶(圖3)。

M.Marker,編號18～33.材料信息同表1

為明確Indel-F/R引物在不同細胞質甘藍型油菜擴增產物的核苷酸序列,對上述nap、pol和cam細胞質甘藍型油菜PCR擴增產物進行測序,測序結果用軟件DNAMAN進行比對分析。結果(圖4)表明,Indel-F/R引物在nap類型材料中擴增產物大小為344 bp,在pol和cam類型中擴增產物大小為251 bp。在pol和cam類型中擴增產物核苷酸相似性為100%;nap類型擴增產物與上述2種細胞質類型(pol和cam)相比,多了一個長度為93 bp的DNA序列的插入(圖4)。綜上,該93 bp的InDel標記可以用作鑒定甘藍型油菜(蕓薹屬植物)nap細胞質的特異分子標記。

紅框中核苷酸序列為nap細胞質特有

2.3 rsp3F/R-1標記擴增結果

利用rsp3F/R-1標記對參試材料進行擴增分析,結果(圖5)表明,該標記在參試材料中擴增出兩種不同大小的片段(222 bp和255 bp)。在2份黑芥材料中(No.14,15)中,1份材料(No.14)擴增出為255 bp的條帶,而在另1份材料(No.15)中,擴增出為222 bp的條帶;在2份埃塞俄比亞芥中(No.12,13)均擴增出222 bp條帶;在參試甘藍型油菜、芥菜型油菜、白菜、甘藍、蕓芥和板藍根材料中,均擴增出255 bp的條帶。結果說明,該標記可以用以區分埃塞俄比亞芥、黑芥和其他蕓薹屬植物。

M.Marker;編號1～17.材料信息同表1

2.4 引物mtSSR2-F/R擴增結果

利用mtSSR2-F/R對參試材料進行擴增分析,結果(圖6)表明,該引物在2份埃塞俄比亞芥(No.12,13)、2份黑芥(No.14,15)中均擴增出大小為420 bp的條帶,在參試甘藍型油菜、芥菜型油菜、白菜、甘藍、蕓芥和板藍根材料中,均擴增出471 bp的條帶。結果說明,該標記也可以區分埃塞俄比亞芥、黑芥和其他蕓薹屬植物。

M.Marker;編號1～17.材料信息同表1

3 討 論

十字花科蕓薹屬植物包含許多重要的油料、蔬菜和飼用作物,細胞質類型的分析對其起源進化和遺傳育種具有非常重要的意義。本研究利用已報道的細胞質特異分子標記對33份蕓薹屬植物進行PCR擴增分析,研究結果表明,筆者前期開發的一步多重PCR技術[14]不僅能夠在一次PCR反應中鑒定pol、ogu、IP-ogu、nap、cam等5種不同油菜細胞質類型,同時發現該方法在埃塞俄比亞芥、黑芥、甘藍、蕓芥和板藍根中擴增出特異的條帶,可以用來鑒定埃塞俄比亞芥、黑芥、甘藍、蕓芥和板藍根等物種的細胞質類型。引物Indel-F/R在nap細胞質甘藍型油菜材料中擴增出一個長度為344 bp的特異條帶,在pol和cam細胞質材料中擴增產物長度為251 bp的條帶;序列比對發現該引物在nap細胞質材料中擴增產物多一個長度為93 bp的插入片段,該InDel標記可鑒別甘藍型油菜的nap細胞質。引物mtSSR2-F/R和rsp3F/R-1也在參試蕓薹屬植物擴增中表現出多態性,可用作區分埃塞俄比亞芥、黑芥細胞質類型的分子標記。研究結果對蕓薹屬植物種質資源的鑒定、保護及育種利用具有重要的參考價值。

Kang等[17]利用全基因組測序及重測序的方法,基于全球480份不同類型芥菜類植物(B.juncea)的細胞核及細胞器(線粒體及葉綠體)基因組的系統發育,對芥菜類植物的起源、馴化和多樣性進行了探究。他們基于線粒體DNA基因組的重測序結果,開發了1對引物Indel-F/R,該引物能在參試芥菜材料中擴增出2種條帶(125 bp和156 bp)。本研究中,筆者利用該Indel-F/R引物,也在參試的2種芥菜型油菜中擴增出了2種不同大小條帶(251 bp和282 bp),它們之間也相差31 bp,然而其片段大小與Kang等[17]研究結果不同,其原因還需進一步探究。更為有價值的是,本試驗發現該Indel-F/R引物在甘藍型油菜nap細胞質材料中,能夠特異地擴增出大小為344 bp的條帶;經測序發現,與pol和cam細胞質類型材料的擴增產物比較,nap類型材料的擴增產物多了一個長度為93 bp的DNA插入片段。因此,該93 bp的InDel標記,可以用作鑒定甘藍型油菜nap細胞質的特異分子標記。目前,對nap細胞質的鑒定主要根據napCMS特異基因orf222判斷[15],本研究開發的該93 bp的InDel標記豐富了nap細胞質的鑒定方法。

前人研究結果表明,黑芥是埃塞俄比亞芥的母本親本種[24]。Yamagishi等[9]完成了黑芥的線粒體基因組測序,通過比較黑芥和埃塞俄比亞芥[7]的線粒體基因組,發現在線粒體基因組的53個基因中,二者僅有1個基因(rps3)存在序列差異;基于該基因第二外顯子上的一個InDel序列,開發了rsp3F/R-1引物。本研究利用該引物對2份黑芥材料進行分析,結果其中1份材料擴增出255 bp的條帶,而另1份材料擴增出222 bp的條帶,而2份埃塞俄比亞芥擴增出222 bp的條帶。本研究結果與Yamagishi等[9]一致,支持黑芥是埃塞俄比亞芥的母本親本種的觀點。同時,在利用一步多重PCR鑒定參試材料細胞質類型時,發現2份黑芥的擴增結果存在差異,表明兩份黑芥的線粒體基因組存在一定的多態性,可以利用親本種黑芥來拓寬埃塞俄比亞芥的細胞質遺傳多樣性。

前人在菜花(B.oleraceavar.italica)細胞質類型鑒定研究中,從21對線粒體SSR(mtSSR)引物和32對葉綠體SSR(cpSSR)引物中,篩選到1對SSR引物(mtSSR2-F/R),可以將菜花雄蕊心皮化細胞質雄性不育材料和正常細胞質材料鑒別開來;序列分析發現,mtSSR2-F/R開放閱讀框比正常材料缺少51 bp,該開放閱讀框位于蕓薹屬植物線粒體基因組orf125與orf108之間,與蘿卜(Raphanussativus)和埃塞俄比亞芥(B.carinata)具有高度同源性[22]。本研究中,筆者利用該對引物對參試材料進行擴增分析,結果發現,該引物在2份埃塞俄比亞芥和2份黑芥中擴增出大小為420 bp的條帶,而在參試的甘藍型油菜、芥菜型油菜、白菜、甘藍、蕓芥和板藍根材料中,均擴增出471 bp的條帶,該標記可以區分埃塞俄比亞芥、黑芥和其他蕓薹屬植物。本研究結果不僅支持Shu等[22]研究結果,而且豐富了前人內容。

總之,本研究以33份蕓薹屬植物為材料,發現前人報道的細胞質特異分子標記具有新的利用價值,研究結果對蕓薹屬植物的起源進化研究和遺傳育種具有重要的參考價值。