光柄菇科真菌的中國新記錄種和偶見種

田慧敏,王秀艷

(赤峰學院 化學與生命科學學院,內蒙古赤峰 024000)

光柄菇科Pluteaceae隸屬于擔子菌門Basidiomycota、傘菌目Agaricales,1972年由Kotlába建立[1]。該科主要鑒別特征為菌褶離生,肉粉色或粉褐色;子實層菌髓為逆兩側型;孢子無色,光滑,非擬淀粉反應,成堆時粉紅色,肉桂粉色;菌柄與菌蓋容易分離,有菌托或菌環,或兩者均無[2]。根據《菌物詞典》第10版分類系統,光柄菇科包括光柄菇屬PluteusFr.、小包腳菇屬VovariellaSpeg.和矮菇屬Chamaeota(W.G.Smith)Earle 3個屬,其中前兩個屬是光柄菇屬的主要類群,大約有350多種[3]。2011年Justo等[4]基于光柄菇科形態學分類和分子系統發育提出將小包腳菇屬Volvariella中菌蓋皮層呈凝膠狀、平均擔孢子長度≥11 μm 的種類歸為 一個新屬托光柄菇屬VolvopluteusVizzini,隸屬于光柄菇科,目前根據真菌索引統計,托光柄菇屬包括9個種和變種。光柄菇科包括4個屬,該科的種很多為世界分布種,多生于腐木或林地腐殖質上,早春至晚秋季節大量發生,該科許多種都是食用菌,如較常見的灰光柄菇(P.cervinus)、網頂光柄菇(P.umbrosus)、獅黃光柄菇(P.leoninus)和草菇(Volvariellavolvacea)等都是營養豐富,肉厚鮮美的食用菌[5],而有的種亦具有藥用價值,如鼠灰光柄菇具有抗糖尿病和抗氧化作用。近期研究發現P.cubensis具有降解除草劑的作用[6-7]。但是個別種具毒性,如柳生光柄菇(P.salicinus)和皺皮光柄菇(P.phlebophorus)分別具神經性和損壞消化系統的毒性[8-9]。然而光柄菇科種間形態特征非常相似,差別不明顯,且在不同環境條件中同種子實體大小、顏色、附屬物等都有差異,包腳菇屬Vovariella和托光柄菇屬Volvopluteus兩屬有的種與鵝膏屬Amanita很相似,形態學鑒定有時會發生誤判的現象,基于rDNA-ITS區域的PCR擴增測序技術如ITS、nLSU和SSU應用于光柄菇科真菌鑒定和親緣關系分析研究提升了該科真菌鑒定效率和準確度[10-12]。目前,中國已報道的光柄菇屬真菌50種,小包腳菇屬真菌16種[13],加之饒固等[14]報道的托光柄菇屬——新記錄種,共67種,遠遠小于實際分布,而國內關于光柄菇科的分類鑒定相關報道較少,筆者采用形態學和ITS序列測序鑒定相結合的方法對3個光柄菇科標本進行分類鑒定,以期明確其分類地位,對光柄菇科真菌資源分布與生物多樣性保護及利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

標本CFSZ10115、CFSZ10295于2013-08-12,CFSZ11537于2016-08-11采自內蒙古自治區赤峰市巴林右旗賽罕烏拉國家級自然保護區,地理坐標:東經118°18′～118°55′,北緯43°59′～44°27′。拍攝生境照片后,晾干、編號,帶回實驗室超低溫冷凍處理,室溫保存于赤峰學院化學與生命科學學院菌物標本室。

1.2 形態鑒定

形態學特征鑒定方法主要參考文獻[15],野外采集后用游標卡尺測量新鮮子實體的菌蓋直徑、菌柄直徑和長度;觀察和記錄菌蓋、菌柄和菌褶的形狀、顏色及其表面是否具附屬物等,觀察和記錄菌褶著生方式、是否有短菌褶、受傷后子實體顏色是否變化,描述菌肉顏色、味道和氣味等。子實體個數以2～5為準。取干燥子實體菌蓋和菌柄表皮、菌褶制成臨時裝片觀察菌蓋和菌柄皮層(皮層菌絲、囊狀體)和子實層顯微結構(擔子、擔孢子、褶側囊體、褶緣囊體),用雙目生物顯微鏡(奧特B203LED,愛迪泰克科技有限公司)在40倍鏡下觀察擔孢子、囊狀體、擔子,菌蓋和菌柄表皮囊狀體、菌絲等各微觀結構的顏色變化,擔孢子隨機測量30個,大小用長寬范圍表示,小梗不計入測量值內,并計算孢子平均長度(avl)、平均寬度(avw)和長寬比(Q值),Q1=長寬比最小值-長寬比最大值,Q2=Q±SD(標準差),菌絲、囊狀體、擔子等測量15～20個長和寬,以長范圍×寬范圍表示,其中菌絲則只測量寬度,寬度以最寬處為準。再將梅爾澤試劑(Melzer’s reagent,2.5%碘化鉀、1.25%碘和50%為氯醛)加入到浮載劑中顯色,用雙目生物顯微鏡觀察孢子顏色有無變化,變藍說明含有淀粉質。

1.3 系統發育樹構建

取子實體干品一小部分菌蓋(含菌褶)用研缽研磨后,稱取30 mg粉末,用DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)提取基因組DNA。每份標本取不同的子實體提取2份DNA。PCR擴增反應正向引物和反向引物為ITS1/ITS4引物[16]。PCR擴增產物經Takara膠純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)純化回收后委托上海生工生物科技有限公司完成測序,所測序列均保存至GenBank數據庫(MG367239、MG367240和MG367242)中。將已測得的ITS序列提交GenBank檢索相似序列,用MEGA7.0.26軟件中的Alignment程序對檢索的相似序列和標本序列進行多重對位排比,并用Analysis程序用Kimura 2-parameter模式計算遺傳距離,Bootstrap循環 1 000次,采用最大似然法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 形態結構特征

2.1.1 羽狀光柄菇PluteusdianaePilát 子實體小。菌蓋直徑3～4.5 cm,扁半球形,中央稍凸起,灰色、灰粉色、灰白色或淺褐色,干后白色,表面具平伏的淺色纖毛(圖1-A);菌肉白色,極薄;菌褶粉紅色,離生,稍密,不等長。菌柄3～6 cm×0.2～0.7 cm,長圓柱形,漸變中空,基部稍膨大,灰白色,基部灰褐色,有縱條紋。

A.子實體;B.擔孢子; C.褶側囊體;D.擔子;E.褶緣囊體;F.菌蓋菌絲;G.柄囊體;標尺(B～G)=20 μm

孢子7.2～8.8(～9.6)μm×4.8～7.4 μm,avl×avw=8.6 μm×6.6 μm,Q1=(1.0～)1.21～1.36(～1.42),Q2=1.24±0.16,近球形或寬橢圓形,無色,光滑,非淀粉質(圖1-B);擔子19.2～33.6(～38.2)μm×7～9 μm,近長橢圓形或短棒狀,無色,光滑,薄壁,基部未見到鎖狀聯合(圖1-D);褶側囊體43.2～74.5 μm×15～24 μm,豐富,近似棒狀或梭形直至瓶狀,無色透明,在Melzer氏試劑中呈現金黃色(圖1-C);褶緣囊狀體35～45(～60)μm×10～19 μm,叢生,近棒狀或囊泡狀,壁薄,光滑,無色近透明,無內含物(圖1-E);菌蓋表皮皮層菌絲形狀不規則、不勻稱,直徑5.52～10.7 μm,位于菌絲的末端細胞的形狀變化較大,圓筒形、棒狀或紡錘形,60～178 μm×10～22.8 μm,未見鎖狀聯合(圖1-F)。菌柄表皮層菌絲平行排列整齊,無色近透明,柄囊體圓柱形或棒狀,35～73 μm× 10～18 μm(圖 1-G)。

研究標本:中國內蒙古赤峰市巴林右旗,賽罕烏拉自然保護區,闊葉林倒木上單生,2013年8月12日,標本號為CFSZ10115。

2.1.2 北方光柄菇PluteusleucoborealisJusto 子實體小,菌蓋直徑2.8～3.2 cm,半球形,白色表面有褐色鱗片,中部具明顯纖毛,表皮開裂翹起成纖毛狀鱗片,近皺(圖2-A)。菌褶白色,離生,邊緣鈍圓,寬約5～7 mm。菌肉白色,薄,傷不變色,氣味和味道未記錄。菌褶離生,初白色,漸粉色,腹鼓狀,不等長,寬0.4～0.7 cm,邊緣平滑。菌柄圓柱狀,3.3 cm×0.4～0.6 cm,白色或灰白色,表面有縱條紋,具褐色鱗片(圖2-B)。

擔孢子6.72～8.4 μm×4.8～6 μm, avl×avw=7.6 μm×5.5 μm, Q1= 1.14～1.36,Q2=1.19±0.16,光滑,近球形,卵圓形或寬橢圓形,無色,非淀粉質(圖2-D)。擔子22～34 μm× 7.5～11 μm,棒狀或寬橢圓形,具4個孢子,壁薄,光滑,無色透明或具褐色染粒(圖2-C)。褶側囊體50～86.6 μm×16～22.8 μm,棒狀或瓶形,頂端著生2～4個角,無色光滑,厚壁,少數頂端鈍圓后的(圖2-E),擔子和褶側囊體在Melzer氏試劑中均呈現金黃色(圖2-F)。褶緣囊狀體豐富,42～68 μm × 12～18 μm,棒狀至狹長棒狀,稀狹長囊泡狀,壁薄,無色近透明。菌蓋皮層菌絲呈束狀排列,近圓筒狀,薄壁,頂端鈍圓或尖細,具隔膜,頂端細胞30～60 μm×6～10 μm,鎖狀聯合未見(圖2-G),菌柄表皮菌絲束狀,近圓筒狀,粗 4～20 μm,末端鈍或稍尖,壁薄,無色或具褐色染色質。

研究標本:中國內蒙古赤峰市巴林右旗,賽罕烏拉自然保護區,樺樹倒木上單生,2013 年 8月 13 日,標本號為CFSZ10295。

2.1.3 密執安托光柄菇Volvopluteusmichiganensis(A.H.Sm.)Justo &Minnis 菌蓋直徑4.2～6.3 cm,幼時呈斗笠狀,成熟后逐漸平展,中央鈍凸,白色或灰白色,表面覆蓋中央發出的放射狀褐色纖毛,中央色深呈黑褐色,向邊緣漸淺,蓋緣不平滑,有不同程度的裂紋(圖3-A);菌肉薄,白色,無特殊氣味;菌褶初白色后呈肉粉色或灰粉色,密,離生,不等長,有從蓋緣發出的短菌褶(圖3-B);菌柄長 5～9 cm× 0.5～1.2 cm,白色至米白色或淺灰黃色,纖維脆骨質,中空至實心,向下漸粗,柄上有白色絨毛,基部更密。菌托白色,苞片狀,寬1～2 cm(圖3-B)。

擔孢子10～13.2(～14.4.0)μm × 6.2～7.4(～8.4)μm,avl×avw=12.6 μm×7.4 μm,Q1=1.42～1.89,Q2=1.64±0.14,橢圓形至長橢圓形,淺褐色,有的中央具一大油滴(圖3-C);擔子 30～52 μm×12～15 μm,棒狀或倒梨形,具4小梗,較細,無色透明,有內含物(圖3-E)。褶側囊體48～102 μm×16～25 μm,紡錘形或燒瓶形,透明,薄壁(圖3-D);褶緣囊體42～62 μm× 18～25 μm,紡錘形、棒狀或者狹橢圓形,透明, 薄壁(圖3-F)。菌蓋表皮層由無色菌絲和膠狀菌絲組成,無色菌絲直徑3～10 μm,菌絲圓柱形,無色,壁薄,有隔膜;膠狀菌絲直徑6～13 μm,分枝(圖3-G)。菌柄表皮菌絲排列整齊,圓柱形,無色或帶有褐色素,細胞壁薄而光滑。柄囊體22～100 μm×11～18 μm, 圓柱形或紡錘形;菌托主要由致密的不規則圓柱形菌絲組成,3～18 μm(圖3-H)。在所有結構中未見鎖狀聯合。研究標本:中國內蒙古赤峰市巴林右旗,賽罕烏拉自然保護區,闊葉林地上單生,2016年 8月 11日,標本號為CFSZ11537。

2.2 rDNA-ITS測序鑒定

2.2.1 供試樣品測序比對結果 對3份標本所測得的ITS序列,通過NCBI的GenBank數據庫使用BLAST檢索獲得36個序列與供試樣品具有較高相似度,物種名稱、登錄號和來源如表1。

表1 與供試光柄菇科3個樣品ITS序列相似的序列

2.2.2 系統發育樹 對所測樣品的ITS序列及其相似序列構建系統發育樹,結果表明:ITS序列聚為三大分支,分別為光柄菇屬Pluteus光柄菇組sectionPluteus、托光柄菇屬(Volvopluteus)和光柄菇屬Pluteus硬毛皮層組 sectionHispidoderma;一側支主要為光柄菇組sectionPluteus的種,包括羽狀光柄菇P.dianae、粉褶光柄菇P.plautus、粒蓋光柄菇P.granulatus、褪色光柄菇P.decoloratus、絨蓋光柄菇P.velutinus;羽狀光柄菇P.dianae位于第一側支,與粉褶光柄菇P.plautus聚在一起;第二側支托光柄菇屬(Volvopluteus)包括密執安托光柄菇V.michiganensis、黏托光柄菇V.gloiocephalus、東方托光柄菇V.earlei、梅德爾托光柄菇V.media和庫克托光柄菇V.cooke,密執安托光柄菇V.michiganensis位于第二側支;第三側支為光柄菇屬Pluteus硬毛皮層組sectionHispidoderma的種,包括北方光柄菇P.leucoborealis、白光柄菇P.pellitus、帽狀光柄菇P.petasatus;灰光柄菇P.cervinus;北方光柄菇P.leucoborealis位于第三側支(圖4)。

圖4 采用最大似然法構建的系統發育樹

3 結論與討論

中國已報道的托光柄菇屬(Volvopluteus)僅有兩個種,即密執安托光柄菇V.michiganensis與黏蓋托光柄菇V.gloiocephalus,黏蓋托光柄菇V.gloiocephalus最初在小包腳菇屬(Volvariella)[25],Justo等[4]通過多基因(nSSU+ITS+nLSU)構建系統發育樹,將Volvariellagloiocephalus轉為Volvopluteusgloiocephalu,該種在中國分布較廣。本研究標本(CFSZ11537和CFSZ 11660)與之明顯不同,根據Justo等[4]描述密執安托光柄菇V.michiganensis區別于其他種的特征為擔孢子平均長度小于12.5 μm,菌蓋邊緣有裂紋;饒固等[14]描述的本種菇菌蓋邊緣也存在裂紋或者條紋,本研究標本菌蓋邊緣也具裂紋,但是裂紋較淺,可能與生境和生長周期有關,擔孢子平均長稍大(12.58 μm),與測量誤差存在一定的關系。分子數據顯示本研究標本與密執安托光柄菇V.michiganensis相似度均在99%以上,與其他種的相似度都在94%以下。在中國主要分布于吉林省延邊市,采集時間在2019年7月,2020年12月提交ITS序列,在Genbank登記(MW242665)[14],本研究標本采集時間和Genbank登記時間都先于饒固等[14]報道的新記 錄種。

羽狀光柄菇PluteusdianaePilát最早在捷克被采集到,隨后是丹麥、俄羅斯和土耳其等少數區域有報道[19],中國未有該種報道,為中國新記錄種。北方光柄菇P.leucoborealisJusto最早報道于俄羅斯西伯利亞地區,在中國分布很少,僅見于西藏昌都市[13],密執安托光柄菇V.michiganensis僅在吉林省有研究報道,二者均為內蒙古新記錄種,由于其出現頻率較低,認為二者均為偶見種。本研究結果擴大了它們在中國的地理分布范圍,為今后科研工作者分類鑒定該科物種提供依據,對光柄菇科真菌的分布及資源現狀做了有益補充,也為菌物資源生物多樣性研究和食用菌開發提供了依據。