單針藻(Monoraphidium sp.)4M-18對4種抗生素的敏感性分析

李 暢, 張云野, 樊 陽, 孫 瑩, 尹紫良,林宜萌, 葛菁萍, 平文祥

(1.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心, 哈爾濱 150500;2.黑龍江大學 生命科學學院 黑龍江省普通高等學校微生物重點實驗室, 哈爾濱 150080)

0 引 言

化石能源的使用帶動了全球經濟的快速進步與發展。自工業革命開始,全球化石能源的消耗一直處于加劇上升狀態。美國能源信息管理局預測,這種消耗狀態至少還要持續20年[1]?；茉吹募觿∠脑谕苿由鐣M步、改善人們生活水平的同時,也導致了氣候變暖[2]和化石能源危機[3]等問題。因此,大力發掘清潔環保、可再生的化石能源替代品,對于滿足國家清潔能源和可持續發展的需求及解決因化石能源大量使用導致的諸多問題具有重要意義。

微藻是一類光學顯微鏡下可見、個體微小、種類繁多、營養價值豐富、分布廣泛、單細胞或簡單多細胞、真核或原核的水生生物[4-7]。微藻經代謝可以在體內累積中性脂肪三酰甘油(Triacylglycerol, TAG),它是生產生物質燃料生物柴油的主要原料。生物柴油是當前公認的可以替代化石能源的清潔能源,利用微藻生產生物柴油具有以下三大優勢:(1)微藻環境適應力強,在淡水、海水甚至污水中都可生長,不與糧食作物競爭土地,且在一定程度上有助于污水的回收利用與凈化處理并減少糧食危機發生的概率[8-12];(2)微藻的光合速率高、繁殖速度快、生長周期短、單位面積生物量產量高[13-14];(3)微藻具有較高的含油量及產油量,其含油量及產油量可分別高達傳統產油作物的10倍和103倍[15]。因此,目前科研工作者致力于利用微藻高產生物柴油的研究,以滿足國家清潔能源和可持續發展的要求。

微藻在培養和純化過程中容易染菌,針對微藻容易染菌的問題,研究人員通常采用物理及化學方法對微藻進行無菌化處理,以獲得微藻純藻株。不同的無菌化處理方法有其各自不同的特點,物理無菌化處理方法操作復雜、工作量大,且僅可除去微藻培養環境中的雜菌,而對微藻體內共生雜菌的去除效果較差;化學無菌化處理方法操作方便、技術簡單,且能夠同時抑制微藻體內及培養環境中的雜菌生長[16-17],對于微藻的無菌化處理更徹底,因此得到研究人員的普遍認可。本文分別采用液體培養和固體培養兩種不同的手段,觀察單針藻4M-18對卡那霉素、四環素、氯霉素和青霉素4種抗生素的敏感性,為單針藻4M-18利用抗生素法進行無菌化處理提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試藻株

單針藻4M-18由黑龍江大學微生物重點實驗室保存。

1.1.2主要培養基

BG11培養基[18]用于單針藻4M-18種子液的擴大培養;TAP含氮培養基[19]用于藻株的混合培養。在相應的液體培養基中加入2.0%～2.5%的瓊脂,用于藻株的固體平板培養。

1.1.3主要試劑

冰乙酸購于天津市光復科技發展有限公司;瓊脂粉、卡那霉素、四環素、青霉素和氯霉素購于上海索萊寶生物科技有限公司;草酸銨、石碳酸、結晶紫、復紅和碘化鉀購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1藻株的培養

利用光照搖床和人工氣候箱,采用混合培養和自養培養兩種方式對藻株進行培養。除特別說明外,藻株的培養均按以下方式進行:光照搖床的培養條件設定為:轉速100 r·min-1、溫度25 ℃、光照強度3 000 lux,每天下午4點開搖床(開光照和轉速按鈕),次日早8點關搖床(關光照和轉速按鈕);人工氣候箱的培養條件設定為:培養溫度25 ℃、光照強度3 000 lux、光暗周期比12 h ∶12 h。

1.2.2單針藻4M-18種子液的培養

取單針藻4M-18藻液,按照10%的量接種于BG11自養培養基中,最終裝液量為200 mL/500 mL(三角瓶),于光照搖床中培養至穩定期(20～22 d),即得種子液。

1.2.3利用TAP含氮培養基培養藻株

取自養培養的單針藻4M-18種子液,按照終止OD680 nm= 0.3接于TAP含氮培養基中,并接入適宜體積的抗生素母液,TAP含氮培養基最終裝液量為250 mL/500 mL(三角瓶),于光照搖床中培養至穩定期。

1.2.4單針藻4M-18在液體培養基中的抗生素敏感性試驗

取自養培養至穩定期的單針藻4M-18種子液,按照10%的比例接種于TAP含氮培養基中,最終裝液量為100 mL/250 mL(三角瓶),按表1所示的抗生素濃度分別加入適宜體積的抗生素母液后,于人工氣候培養箱中培養,每天固定時間早晚各搖晃藻液一次,避免藻細胞沉底影響其生長;同時,每天早8點取樣測定藻細胞密度,觀察藻細胞生長情況。每個濃度抗生素均設置3個平行試驗,以降低試驗誤差?？股貪舛忍荻鹊恼{整方法為:在最終裝液量為100 mL/250 mL(三角瓶)的單針藻4M-18培養液中,分別加入濃度為100 mg·mL-1的青霉素母液0、 50、 100、 150、 200和250 μL,調整培養液中青霉素終濃度分別為0、 50、 100、 150、 200和 250 mg·mL-1。以上為青霉素濃度梯度的調整方法,其他抗生素與之相同。

表1 不同種類抗生素的濃度梯度設定

1.2.5單針藻4M-18在固體培養基中的抗生素敏感性試驗

取自養培養至穩定期的單針藻4M-18種子液,利用血球計數板計算藻細胞密度,以確定藻液的稀釋倍數。利用無菌0.9%NaCl溶液稀釋藻液,取稀釋好的藻液100～200 μL均勻涂布于含有不同濃度抗生素(0、100、150和200 mg·L-1)的TAP含氮培養基的固體平板上(保證每個平板上200～300個藻落即可),于人工氣候箱中培養15 d后,觀察不同濃度抗生素在平板上對雜菌的抑制作用及對單針藻4M-18生長的影響。每個濃度抗生素均設置3個平行試驗,以減小試驗誤差。固體培養基中抗生素的選擇及濃度梯度設定如表2所示。

表2 不同濃度青霉素處理15 d后單針藻4M-18的生長情況

2 結果與討論

2.1 單針藻4M-18的雜菌污染情況

在利用TAP含氮培養基培養單針藻4M-18的過程中,發現藻液極易受雜菌污染,通過革蘭氏染色及鏡檢發現,藻液所染雜菌主要為革蘭氏陽性球菌及革蘭氏陽性桿菌,如圖1所示。

注： 圓圈內為藻液中的革蘭氏陽性球菌; 三角形內為藻液中的革蘭氏陽性桿菌; 長方形內為單針藻4M-18細胞。

2.2 單針藻4M-18在液體培養基中的抗生素敏感性試驗

根據不同抗生素抗菌譜范圍的不同,選擇卡那霉素、四環素、氯霉素和青霉素4種抗生素,在液體培養基中對單針藻4M-18進行了抗生素敏感性試驗。

2.2.1卡那霉素對單針藻4M-18生長的影響

卡那霉素是一種氨基糖苷類抗生素,對大多數革蘭氏陰性菌具有強大的抑制作用。圖2為卡那霉素對單針藻4M-18生長的影響結果,由圖可知,20 mg·L-1卡那霉素處理后的單針藻4M-18細胞在培養0～4 d時處于延滯期,4～6 d時處于急劇生長期,且藻細胞密度在6 d時與對照組持平。由于經20 mg·L-1卡那霉素處理后的單針藻4M-18細胞生長延滯期過長,因此不選擇卡那霉素作為最優抗生素。余旭亞等利用卡那霉素在液體培養基中對單針藻FXY-10進行抗生素敏感試驗,發現25～200 mg·L-1卡那霉素均可顯著抑制藻細胞的生長[20],本試驗結果與其一致。

圖2 卡那霉素對單針藻4M-18生長的影響

2.2.2四環素對單針藻4M-18生長的影響

四環素是一種能防治革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引發的疾病、維持人體健康的一類抗生素[21]。圖3為四環素對單針藻4M-18生長的影響,由圖可知,不同濃度的四環素對單針藻4M-18生長均有不同程度的抑制作用。當四環素濃度為10 mg·L-1時,微藻有生長的現象,但與未添加抗生素組相比,生長相對緩慢,而其他四環素濃度下的微藻基本不生長。張茜等研究發現,在液體培養基中的低濃度四環素(10 mg·L-1)可抑制富油新綠藻(Neochlorisoleoabundans)的生長[22],本試驗結果與其相似。

圖3 四環素對單針藻4M-18生長的影響

2.2.3氯霉素對單針藻4M-18生長的影響

氯霉素是從委內瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuela)中分離提取的廣譜抗生素,對許多需氧革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌以及厭氧的菌質體都有抑制作用[23]。圖4為氯霉素對單針藻4M-18生長的影響結果,從圖中可以看出,當氯霉素濃度為10 mg·L-1時,單針藻4M-18藻株生長緩慢;在抗生素濃度高于10 mg·L-1時,藻株幾乎不再生長,受到明顯的抑制。這與余旭亞等研究發現10～200 mg·L-1氯霉素可抑制藻細胞生長的結果[23]一致。

圖4 氯霉素對單針藻4M-18生長的影響

2.2.4青霉素對單針藻4M-18生長的影響

青霉素通過抑制細菌細胞壁四肽側鏈和五肽交連橋的結合,阻礙細菌細胞壁合成,從而發揮殺菌作用[24]。圖5為青霉素對單針藻4M-18生長的影響結果,由圖可知,當青霉素濃度為50和150 mg·L-1時,藻細胞呈現S型增長,且在培養周期5～6 d的藻細胞密度高于對照組。由圖6可知,150 mg·L-1青霉素能夠有效抑制雜菌生長,且經兩種濃度青霉素(50和150 mg·L-1)處理后的單針藻4M-18藻液,藻細胞形態無明顯變化,均呈現彎曲的月牙型,表明濃度為150 mg·L-1的青霉素對單針藻4M-18的細胞形態無影響。有文獻報道,青霉素可以廣泛應用于微藻的無菌化處理,其能夠有效抑制微藻共生雜菌的生長,但對微藻的生長抑制不明顯,一定濃度的青霉素還可促進微藻細胞的生長[24],這與本試驗結果相似。劉曉娟等研究發現,在液體培養基中添加50 mg·L-1青霉素,對眼點擬微綠球藻(Nannochloropsisocutala)的生長無明顯影響,且在添加青霉素2 d后,培養液中的共生雜菌數目有所減少[25];李靜紅等研究發現,當培養液中的青霉素終濃度為1.5 g·L-1時,波吉卵囊藻(Oocystisborgei)的生長才被抑制[26]。本試驗結果與劉曉娟和李靜紅等的研究結果有一定差異,可能是由于不同藻株之間存在種屬差異性和特異性。因此,在液體培養基中可選擇添加150 mg·L-1青霉素作為單針藻無菌體系建立的備選抗生素。

圖5 青霉素對單針藻4M-18生長的影響

圖6 不同濃度青霉素處理7 d后單針藻4M-18的染菌情況(400×):(a) 0 mg·L-1 ; (b) 50 mg·L-1;(c) 150 mg·L-1

2.3 單針藻4M-18在固體平板上的抗生素敏感性試驗

藻株在固體培養基和液體培養基中對抗生素的耐受濃度是不同的[27],而且固體平板培養法可以直觀地反映微藻在不同濃度抗生素的固體培養基中能否生長存活,方法簡便[20]。以TAP含氮液體培養基中添加的抗生素種類和濃度為基礎,進一步在固體平板上確定單針藻4M-18所耐受的抗生素濃度。在固體平板上,不同濃度青霉素對單針藻4M-18藻落生長和藻落形態的影響及對雜菌的抑制情況如表2和圖7所示。

圖7 不同濃度青霉素處理15 d后單針藻4M-18的生長、形態和染菌情況: (a) 0 mg·L-1;(b) 100 mg·L-1; (c) 150 mg·L-1;(d) 200 mg·L-1

在固體平板上,100 mg·L-1青霉素對單針藻4M-18的生長無顯著影響,同時未見其他雜菌生長。與對照組相比,藻落形態無明顯變化,均表現為大而飽滿有光澤,該結果與張茜等報道的“同一種藻在固體和液體培養基中對同一種抗生素敏感度不同”的結論[22]相似。因此,在固體平板上可選擇添加100 mg·L-1青霉素作為單針藻無菌體系建立的備選抗生素。綜上所述,由于不同藻株之間存在種屬特異性及差異性,在利用抗生素抑菌法對藻株進行無菌化處理時, 應根據藻株的性質來選擇適宜種類及濃度的抗生素。

3 結 論

以實驗室保存的單針藻4M-18為出發藻株,利用4種抗生素對單針藻4M-18進行敏感性試驗,最終選用青霉素對單針藻4M-18進行無菌化處理。在液體和固體培養基中,150和100 mg·L-1青霉素能夠有效抑制單針藻4M-18共生雜菌的生長,同時對藻細胞(藻落)生長及形態無顯著影響。