超高效液相色譜-串聯質譜法檢測食用菌中的游離棉酚

◎ 王乾麗，黃永橋，簡銀池，扶 勝，朱明燕

（1.貴州省檢測技術研究應用中心，貴州 貴陽 550000；2.食品安全與營養（貴州）信息科技有限公司，貴州 貴陽 550000）

棉酚俗稱棉毒素，是錦葵科棉屬植物色素腺產生的多酚二萘衍生物[1]，易溶于丙酮、乙腈等有機溶劑[2]。研究表明，游離棉酚是一種神經性、血管性、細胞性有毒物質[3]，人們食用含有棉酚的食物后可引起低血鉀癥，損傷內臟器官以及可能導致不孕等癥狀[4-6]。我國是食用菌栽培生產大國，食用菌的培養基材料一般為有機廢料或其副產品，如鋸末、玉米稈、棉稈、果殼、茶副產品等，而棉籽殼作為萬能的培養基被廣泛應用于食用菌的栽培中，棉籽殼中含有大量的棉酚，食用菌在生長過程中會吸收富集棉籽殼中的游離棉酚，人們食用含有棉酚的食用菌后可能會影響身體健康。因此對食用菌中的游離棉酚進行檢測具有重要的現實意義。

目前，關于研究食用菌中棉酚的檢測方法較少，也未有相關的檢測標準，棉酚檢測方法采用比色法、分光光度法、高效液相色譜法等，以上方法存在方法選擇性不強、操作復雜、基質干擾大，測定結果不準確的問題，高效液相色譜質譜聯用法具有靈敏度高、準確度高、精密度好等特點，近幾年也被廣泛應用于棉酚的檢測，研究較多的是棉酚在動物源食品、植物源食品、農副產品以及飼料中的檢測，但采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定食用菌中的游離棉酚較少。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器與設備

Agilent 1290-6470超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀，配有ESI源（美國Agilent公司）；攪拌機Blixer3（法國ROBOT COUPA公司）；LT2002電子天平（常熟市天量儀器有限公司）；離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）。

1.1.2 主要試劑

棉酚（純度＞95%，上海安普實驗科技股份有限公司）；丙酮（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，上海安普實驗科技股份有限公司）；乙酸銨（分析純、西亞試劑）；鹽酸（優級純，純度36.0%～38.0%，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 標準溶液配制

精密稱取10 mg棉酚（精確至0.01 mg）于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解混勻并定容至刻度線，配制成質量濃度為1 000.0 μg·L-1標準儲備液，根據后續實驗需要移取不同標準儲備液于棕色容量瓶中，避光備用。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Agilent公司）；流動相A：0.1%甲酸水（含2 mmol·L-1乙酸銨）溶液，流動相B：乙腈；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣體積：2.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相洗脫梯度表

1.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源，負離子掃描；多反應監測；毛細管電壓：4.5 kV；霧化器壓力：40 psi；干燥氣流速：10 L·min-1；干燥氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：10 L·min-1；鞘氣溫度：300 ℃；其他質譜條件見表2。

表2 質譜分析參數表

1.5 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.01 g）搗碎后的組織樣品于50 mL離心管中，準確加入15 mL丙酮-鹽酸（0.5 mol·L-1）-水（13∶1∶6，v/v/v）混合溶劑，加入1粒陶瓷均質子，渦旋振蕩20 min后離心，取出上清液，用10 mL提取液重復提取一次，用提取液定容至25 mL。靜置片刻后，取上清液過0.22 μm PTFE濾膜，待測。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取液的選擇

不同提取液的提取效率是不同的，提取液的選擇除了要考慮目標化合物的理化性質外，還要考慮不同基質、提取量、提取環境等因素。張文華等[7]比較了丙酮和乙腈的提取效率，其中以丙酮-水混合溶劑的提取效果較理想。張靜等[8]比較了游離棉酚在純丙酮溶液、丙酮-水溶液、丙酮-磷酸溶液中的穩定性差異，其中丙酮水的變異系數較小，穩定性好。本文比較了丙酮-水（7∶3，v/v）、丙酮、丙酮冰乙酸、丙酮-鹽酸-水（13∶1∶6，v/v/v）的提取效率。由表3可知，丙酮-水和丙酮-鹽酸-水的提取效率較好，同時考慮棉酚為多酚化合物在偏酸性環境中降解不明顯，穩定性高，因此本試驗樣品前處理提取液選定丙酮-鹽酸-水。

表3 不同提取溶劑回收率比較表

2.1.2 提取液最佳鹽酸濃度的選擇

棉酚的穩定性受pH的影響，本實驗就鹽酸濃度對回收率的影響及其精密度進行了比較，將濃鹽酸稀釋成0.1 mol·L-1、0.2 mol·L-1、0.5 mol·L-1、0.8 mol·L-1和1.0 mol·L-1共5個濃度，與丙酮和水配制成丙酮-鹽酸-水（13∶1∶6，v/v/v）的混合提取液，在空白香菇中添加2.5 ng·mL-1棉酚，用上述不同鹽酸濃度的混合溶液提取，依次進樣測定回收率，每個樣品做平行試驗6次。由表4可知，當鹽酸濃度為0.5 mol·L-1時，回收率最高，隨著鹽酸濃度的增加，回收率開始降低，當鹽酸濃度為1.0 mol·L-1時，回收率降至60.4%。

表4 不同鹽酸濃度下香菇提取液的回收率實驗結果表（n=6）

為選擇更合適的提取液，本文選取陰性香菇樣品，添加0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1共3個不同濃度棉酚，每個濃度分別用鹽酸濃度為0.4 mol·L-1、0.5 mol·L-1、0.6 mol·L-1的丙酮-鹽酸-水（13∶1∶6，v/v/v）混合提取液充分提取，3個鹽酸濃度混合提取液的回收率都比較理想，鹽酸濃度為0.5 mol·L-1時回收率略高，比較3個濃度的回收率精密度，當鹽酸濃度為0.4 mol·L-1時各添加量的相對標準偏差為5.2%～8.9%，鹽酸濃度為0.5 mol·L-1時各添加量的相對標準偏差為3.8%～6.1%，鹽酸濃度為0.6 mol·L-1時各添加量的相對標準偏差為5.8%～9.8%，即鹽酸濃度為0.5 mol·L-1時的回收率精密度較好，說明提取液為丙酮-鹽酸（0.5 mol·L-1）-水（13∶1∶6，v/v/v）時，穩定性更好，見表5。

表5 3種不同鹽酸濃度的回收率和精密度表（n=6）

2.2 方法學評價

2.2.1 方法的標準曲線、檢出限、定量限

本方法采用基質工作曲線作為定量曲線對基質效應進行補償，結果表明，棉酚在0.25～25.00 μg·L-1的質量濃度范圍內相關系數（R2）大于0.997，方法的檢出限（S/N=3）為1.0 μg·kg-1，定量限（S/N=10）為3.0 μg·kg-1，結果見表6。

表6 棉酚的線性范圍、線性方程、相關系數（R2）、檢出限及定量限表

2.2.2 加標回收及精密度考察

選取香菇、平菇和金針菇陰性樣品，分別添加2 μg·kg-1、4 μg·kg-1、10 μg·kg-13個不同濃度的標準溶液，按照優化條件進行提取和分析。如表7所示，方法的平均回收率為86.1%～99.8%，相對標準偏差為2.3%～8.2%，結果表明該方法的準確度和精密度能夠滿足食用菌樣品中痕量游離棉酚的含量測定。

表7 食用菌中樣品的加標回收率和相對標準偏差表（n=6）

3 結論

本研究針對食用菌具有較強的基質效應及棉酚易氧化降解的特點，對前處理提取液進行了優化，建立了食用菌中游離棉酚殘留量的分析檢測方法。本實驗的樣品前處理步驟簡單省時，具有易用性和較高分析效率，該方法回收率高，檢出限低、靈敏度和重現性好，能夠滿足食用菌中痕量棉酚檢測要求，為食用菌的安全監管提供可靠的技術支撐。