Atoh1調控毛細胞再生與分化的研究進展

欒珺 韓鋒產

濱州醫學院生物化學與分子生物學教研室，山東省醫藥衛生耳科遺傳病重點實驗室（煙臺 264003）

感音神經性耳聾是世界范圍內的多發病，有多種致病因素，主要包括遺傳因素、氧化應激、衰老、耳蝸血管變化和環境因素（如噪音、耳毒素、氨基糖苷素等），大部分耳聾伴有耳蝸毛細胞和螺旋神經元的死亡或退化[1]。耳蝸毛細胞(Hair Cells,HCs)的丟失或損傷引起內耳感覺細胞的損傷會導致感音神經性耳聾[2]。迄今為止，已有150 多種基因突變或異常會導致聽力損失[3]，高發的遺傳性耳聾相關致病基因主要包括GJB2，SLC26A4和MT-RNR1[4]，但仍有很多耳聾相關新基因及新突變有待發掘。

非哺乳類脊椎動物（如鳥類）和斑馬魚側線具有毛細胞再生能力，毛細胞丟失后，可通過再生毛細胞來恢復受損的聽力[5]。兩周齡左右的哺乳動物的毛細胞雖自我再生能力有限，但通過調控相關信號通路或基因仍可再生；而成年哺乳動物的毛細胞和支持細胞(Supporting Cells,SCs)已達到最終分化狀態，其毛細胞損傷將導致不可逆轉性聽力損失，進而造成永久性感音神經性聽力喪失[6]。

Atonal homolog 1(Atonal homolog 1,Atoh1)對耳蝸毛細胞和耳蝸核(Cochlear Nuclei)的發育至關重要[7]，其通過與多種信號轉導通路的相關分子共同作用以驅動毛細胞的再生。本文綜合論述了Atoh1調控毛細胞再生與誘導干細胞分化毛細胞的研究進展，探討通過調控Atoh1 基因的表達以修復毛細胞損傷所致聽力障礙的新途徑。

1 Atoh1的結構、表達特征及功能

Atoh1基因是果蠅原核基因Atonal的同源物。在小鼠Atoh1基因又稱為Math1基因，在人稱為HATA1基因[8]。該基因含一個外顯子，無內含子，編碼序列長度為1.053Kb[9]；編碼產物Atoh1 是一轉錄因子，由354個氨基酸組成[10]，分子量為37.9kDa，具有高度保守長度約為56 個氨基酸殘基的basic Helix-Loop-Helix(basic Helix-Loop-Helix,bHLH)模體[9]，被認為是毛細胞分化的關鍵啟動因子。

毛細胞的形成可以通過HCs 的分化、SCs 的有絲分裂或SCs 的轉分化來實現，其形成與發育依賴于Atoh1 的表達。研究發現，在轉基因小鼠中，Atoh1 先在小鼠胚胎發育初期的耳蝸底部附近表達，在E13.5 到E17.5 時到達峰值。在出生后的第1周，Atoh1 表達相比于E17.5 顯著減少；到出生后第6 天(Postnatal day 6,P6)，Atoh1 幾乎不表達；在P1-6期間，Atoh1可誘導SCs轉分化為未成熟的HCs。但隨著小鼠周齡的增加，SCs 轉分化為HCs 的能力逐漸消失，在2周左右完全喪失[11]。

Atoh1 能夠協調細胞命運，調節細胞周期和增殖。研究發現，在Atoh1基因表達過的小鼠模型中，Atoh1基因能夠使內耳祖細胞分化為毛細胞并調控毛細胞的分化及活性[12]；在Atoh1基因敲除的小鼠模型中，哺乳動物將失去形成耳蝸毛細胞和前庭毛細胞的能力[13]。

Shuting Li 等[14]研究發現Atoh13*HA-P2A-Cre小鼠是研究毛細胞分化的理想遺傳模型。陳志婷等[15]選用重組腺病毒-Math1-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)，優化體外轉染條件，轉染293T 細胞，發現重組腺病毒載體介導的細胞轉染率達到了94%。Li W 等[16]采用一種新型耳蝸外植體培養系統（包括感覺上皮和周圍的骨結構），以攜帶CMV 啟動子驅動的人ATOH1(Ad-Atoh1)腺病毒感染培養的Atoh1-GFP 轉基因成年小鼠耳蝸，在轉基因小鼠耳蝸外植體中檢測到大量Myo7a+、Pvalb+的表達，證明Atoh1基因過表達可促進SCs 轉分化為HCs。

2 Atoh1在毛細胞發育過程中的調控機制

2.1 Atoh1與其上下游調控基因共同作用來驅動毛細胞再生與分化

Atoh1 在內耳毛細胞分化中起重要作用，Sox2、Eya1和Six1是Atoh1 上游調控基因，Gfi1、Pou4f3和Barhl1是Atoh1下游調節基因。

Sox2 是具有HMG 結構域的轉錄因子，在胚胎和各種器官的祖細胞以及發育和成熟的神經系統中廣泛表達,可通過刺激Atoh1 的表達以促進毛細胞的形成[17]。Kempfle JS 等[18]利用Sox2-Cre-ER;Sox2flox/flox條件性敲除小鼠Sox2 基因，發現在感覺祖細胞(Sensory Progenitors) 形成后，Sox2基因的缺失能夠阻斷毛細胞分化，表明Sox2 不僅是形成感覺祖細胞的必要條件，而且是感覺祖細胞分化為毛細胞所必需的。

Eya1/Six1主要參與耳的早期發育，是形成耳蝸和誘導Sox2 表達所必需的。Ahmed M 等[19]的研究結果表明，在小鼠耳蝸外植體中，Eya1/Six1 可以通過激活Atoh1 依賴途徑及非依賴的途徑，誘導Sox2低表達的非感覺上皮中的毛細胞再生。Sox2 與Eya1/Six1 共表達，通過直接結合Atoh1基因3'端增強子，上調Atoh1表達，從而決定毛細胞命運。

Gfi1基因在耳蝸毛細胞發育時開始表達，Gfi1基因缺失會導致胚胎耳蝸毛細胞無法發育成完全功能的成熟耳蝸毛細胞。Lee S等[20]研究發現，與單獨的Atoh1基因表達相比，Atoh1與Gfi1基因共表達導致4 周后新的毛細胞樣細胞(HC-Like Cells,HCLC)增加了6.2 倍，在整個耳蝸中檢測到了新的HCLC，其未成熟的靜纖毛存活至少8周。

Pou4f3 能控制毛細胞的分化、成熟及存活[21]。在Walters BJ 等[22]的相關研究中發現，在成年小鼠，與單獨的Atoh1基因表達相比，Pou4f3和Atoh1基因聯合表達可使更多的SCs 轉化為HCs。Costa等[23]同樣發現Atoh1基因單獨表達不能誘導毛細胞再生，而與Pou4f3和Gfi1基因聯合表達后，無論在體外還是在體內都能夠有效地促進小鼠胚胎干細胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)分化成毛細胞樣細胞。

Barhl1 在內耳高度表達，對于介導聽力和平衡之聽覺毛細胞的持續生存至關重要[24]。Barhl1基因是毛細胞中Atoh1潛在的靶點，Atoh1與位于3'端增強子的E3 位點結合以激活Barhl1基因的表達，從而驅動前感覺細胞分化為新生毛細胞[25]。Menendez L 等[26]研究證實Barhl1基因的靶向敲除雖不影響mESCs 向早期原始外胚層樣細胞和耳祖細胞的分化，但強烈抑制毛細胞樣細胞的分化。

正常毛細胞發育是否成功在于聽覺毛細胞的成熟和維持。Atoh1通過與以上因子共同作用來驅動毛細胞的分化與成熟，這為我們提供了另一種基因治療的方法。

2.2 調控Atoh1相關信號轉導通路與毛細胞再生

Notch、Wnt/β-catenin、Sonic Hedgehog(Sonic Hedgehog,SHH)及Fibroblast Growth Factor(Fibroblast Growth Factor,FGF)等相關信號轉導通路是耳蝸發育過程中決定前感覺細胞增殖和細胞命運的重要途徑。抑制Notch 信號通路或促進Wnt/βcatenin、SHH 或FGF 信號通路，都是毛細胞再生的有效的方法。Notch 信號通路可通過抑制Atoh1基因表達來抑制毛細胞增殖及分化。當Notch信號分子與Jag2 和Deltal（Notch 信號配體）結合后，NICD(Notch1 Intracellular Domain)從膜中釋放，通過上調Atoh1 基因的抑制因子Hes1 及Hes5，阻斷Atoh1 的表達，進而抑制毛細胞及支持細胞的增殖與分化[27]。有研究發現，可以采用γ-分泌酶抑制劑以抑制Notch 信號通路，從而促進毛細胞和支持細胞的增殖與分化[28]。Wnt/β-catenin 信號通路的激活能夠抑制細胞的凋亡,減少毛細胞的損傷,甚至促進毛細胞增殖與再生[29]。β-catenin 是一種多功能連環蛋白，在Wnt信號的激活下，可從胞漿進入胞核，形成β-catenin/Tcf 復合物，驅動Wnt 靶基因表達，進而促進毛細胞的再生。有研究表明，β-catenin 與Atoh1基因3'端增強子相互作用可介導新生耳蝸Lgr5+細胞亞群的增殖和分化，從而克服成年哺乳動物毛細胞無法再生的缺陷[30]。SHH 信號通過上調Atoh1-Brn3.1 信號轉導途徑，促進耳蝸神經祖細胞的分化。在SHH 信號刺激下，Atoh1 可以調節顆粒神經祖細胞(Granular Neural Progenitor cells,GNPs)中SHH 依賴性增殖并誘導其分化；Gli1是SHH 信號通路的下游基因，在沒有SHH 信號的情況下，Atoh1 基因的過度表達不能支持GNPs 的增殖[31]。FGF 負調控Atoh1 的表達，從而防止毛細胞的過早分化。其主要是通過激活SHH 信號通路，維持Notch 效應物Hey1、Hey2 的表達水平[27]。FGF 信號能控制前感覺細胞在耳蝸發育過程中向毛細胞和支持細胞的分化[32]。FGF 信號的共同選擇可能會使支持細胞無需與周圍的毛細胞直接接觸，實現內耳復雜細胞鑲嵌的進化與重塑[33]。

3 Atoh1依賴性干細胞向毛細胞的分化

干細胞能分化為各種不同類型的組織細胞，具有分化毛細胞的潛能。近期研究表明，骨髓間充質干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)具有高擴增、遺傳穩定、易于分離培養、低免疫源性和免疫調節等功能，可促進神經組織修復[34]。Kazuo等[35]研究發現BMSCs 在適宜條件下可誘導生成HCLCs，并檢測到毛細胞標志物MyosinⅦA的表達；Lopez-Juarez,A 等[36]通過耳蝸造孔術法把Atoh1-GFP 表達小鼠的外毛細胞祖細胞(Outhair Progenitor Cells,OPCs)移植入成年耳毒性模型豚鼠前庭室，發現移植的耳祖細胞可以存活并遷移到耳蝸感覺上皮，其中一些細胞開始分化為表達標記蛋白的耳感覺細胞。Zhang YL 等[37]發現，人脂肪來源的間充質干細胞具有分化為人毛細胞祖細胞的潛力，小的活化RNA(small activating RNA,saRNA)能夠靶向作用于ATOH1基因并上調其表達；將能夠有效、持續激活ATOH1基因表達的saRNA 轉染到毛細胞祖細胞中，10 天后成功檢測到內耳毛細胞特征性標志物Pou4f3和Myo7a的表達。

4 總結與展望

Atoh1 是bHLH 轉錄因子家族中的一員，表達于耳蝸毛細胞，調控毛細胞的再生與分化。Atoh1可與其上下游調控分子相互作用，調節多種細胞信號轉導通路，誘導耳蝸毛細胞的再生。目前，針對Atoh1基因的毛細胞再生實驗雖已取得一定的效果，但仍然處于初級階段。在未來，靶向調控耳祖細胞或干細胞的Atoh1及其相關基因，將為毛細胞損害的臨床治療提供新途徑。