滸苔綠潮暴發期間海水溶解有機碳的生物可利用性及其碳匯作用

馮秀婷 ,李佳怡,吳旺池,李鴻妹,張永雨,石曉勇,5*,湯坤賢

(1.中國海洋大學化學化工學院,山東 青島 266100;2.中國科學院青島生物能源與過程研究所,山東 青島 266101;3.福建省海洋生態保護與修復重點實驗室,福建 廈門 361005;4.青島科技大學海洋科學與生物工程學院,山東 青島 266042;5.國家海洋局海洋減災中心,北京 100194;6.自然資源部海洋生態保護與修復重點實驗室,福建 廈門 361005;7.自然資源部第三海洋研究所,福建 廈門 361005)

海洋中的DOC通常擁有復雜的組分,由于不同組分的生物可利用性不同,使得其在海洋中的周轉時間也不盡相同。DOC的生物可利用性通常通過微生物降解實驗確定,其中活性DOC(LDOC)的生物可利用性很高,可在數小時至數天內被微生物快速利用或轉化,難以在海洋中積累;半活性DOC(SLDOC)的生物可利用性次于LDOC,其周轉時間為數周至數月;惰性DOC(RDOC)則擁有強的抗降解能力,難以被微生物利用或轉化,可在海洋中儲存幾年至幾十年,甚至上千年[1]。RDOC已被證實是海洋中最大的DOC儲庫,其碳儲量約為630 Pg,占海洋總有機碳庫的90%～95%[2],其能夠將碳以溶解態形式長期儲存在海水中,是海洋碳匯的重要組成部分[3]。以往的研究發現大型海藻通過光合作用可產生大量LDOC[4],而海洋微型生物碳泵(microbial carbon pump)理論指出部分LDOC被微生物利用后可進一步轉化為RDOC[3,5-7]。

海洋溶解有機物中能夠吸收紫外線和可見光輻射并發出熒光的部分被稱為熒光溶解有機物(FDOM),通常作為DOC組分的重要表征之一[8-9]。近年來,三維熒光光譜結合平行因子分析技術(EEMs-PARAFAC)被廣泛用于FDOM的成分分析[10-12]。根據其激發和發射的波長特征(Ex/Em),FDOM通常被分為類蛋白和類腐殖質兩大類,類蛋白組分由于活性較高,在海洋中的周轉時間較短,常被作為LDOC的主要表征組分;而類腐殖質組分的穩定性較高,通常不易被微生物利用或轉化,被用于表征RDOC的存在[6,13-16]。

2007—2021年,滸苔(Ulvaprolifera)綠潮在我國南黃海連續15年暴發,其最大覆蓋面積可達6.1×104km2,占黃?？偯娣e的近1/10[17-18]。滸苔作為主要肇事藻種,是一種機會主義大型海藻,擁有很高的初級生產力,可通過光合作用吸收CO2,同時以溶解有機碳(DOC)等形式向周圍水體釋放大量的有機物質。滸苔的DOC釋放速率非常高,滸苔釋放碳的速率約73.8 μmol/(g·h)(干重),這主要歸因于其藻體自身快速的碳周轉率和較高的表面積/體積比[19]。以往的調查發現,滸苔綠潮暴發海水的DOC濃度顯著高于正常海水,高出約1.2倍[20]。然而,滸苔綠潮貢獻的這些DOC能否長久儲存在于海洋中主要取決于DOC的生物可利用性,只有那些不容易被微生物利用的惰性DOC(RDOC)可長期存留在海洋中,貢獻于近海碳庫[21-22]。

滸苔綠潮暴發貢獻的大量DOC的生物可利用性對DOC在海洋中的周轉時間及最終命運至關重要,然而目前尚無關于綠潮暴發海水中DOC的生物可利用性的報道,滸苔綠潮暴發對近海碳庫的影響機制也不清晰。因此,本研究選擇滸苔綠潮大規模暴發時期(2019年6月),在滸苔暴發站位富集DOC進行長期(300 d)的微生物降解實驗,并選擇無滸苔站位作為對照,期望通過DOC濃度和FDOM熒光組分的動態變化特征反映滸苔綠潮暴發對DOC生物可利用性以及近海RDOC儲庫的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預處理

于2019年夏季(6月10日—20日)滸苔綠潮大規模暴發時期搭載“科學三號”科考船進行現場采樣,根據滸苔綠潮暴發實況,在滸苔暴發海區選取3個大量滸苔覆蓋站位(A、B、C)各采集30 L表層海水(圖1),并選取距離較遠的無滸苔海區(D、E、F)作為對照,每個站位同樣采集30 L表層海水。并用CTD剖面儀(Seabird 911 Plus)對所有站位的溫度、鹽度和葉綠素濃度(Chl a)等環境參數進行監測?，F場采用固相萃取方法富集海水中的DOC,具體而言,首先將海水過濾20 μm篩絹,再過濾0.7 μm GF/F濾膜(450 ℃預灼燒,5 h),收集濾液,使用6 mol/L H2SO4(ACS,Fisher Scientific)將海水酸化至pH=2.5,之后使用C18固相萃取柱(HF Mega BE-C18,10 mg,60 mL,Agilent)對DOC進行富集。富集后的DOC用甲醇洗脫,N2吹干,重復溶解于50 ml滅菌人工海水(115 ℃,30 min)中用于后續的微生物降解實驗。C18固相萃取方法的DOC回收率一般為29%～30%[23],本研究的DOC回收率為27.3%±1.0%。這主要是由于固相萃取方法主要依賴于非極性固定相和疏水相交互作用優先選擇海水中的中性和非極性分子,從而導致部分極性分子缺失[24-25]。因此,固相萃取富集的DOC中通常富含惰性組分(例如類腐殖質組分)[23,26-27]。然而,由于DOC生物可利用性測定實驗通常依托于微生物的長期降解過程[5],原位海水中的DOC濃度不足以進行長期降解,因此通過固相萃取方法富集海水DOC是目前較為通用的方法[23]。

圖1 2019年滸苔綠潮暴發時期現場調查站位Fig.1 Sampling stations during Ulva prolifera green tide in 2019A、B、C為大量滸苔覆蓋站位,D、E、F為無滸苔站位。

在富集DOC的同時,分別在上述站位再采集30 L海水進行微生物富集。首先將海水預過濾20 μm篩絹去除海水中的大顆粒物質,再過濾3.0 μm 濾膜(PC,Millipore)除去大部分浮游生物,最后過濾0.2 μm 濾膜(PC,Millipore),濾膜上截留的即是大部分海洋微生物[28]。將0.2 μm濾膜置于滅菌離心管中并加入滅菌人工海水(115 ℃,30 min),旋渦震蕩10 min后取出濾膜,離心管中洗脫液即為微生物富集液。

1.2 長期DOC微生物降解實驗

為了探究滸苔綠潮暴發海水DOC的生物可利用性,將大量滸苔覆蓋站位富集的DOC與微生物混合,在室溫、黑暗條件下進行長期(300 d)的微生物降解實驗。具體而言,將分別含有富集DOC和微生物的人工海水按1∶1混合(體積比),并繼續加入人工海水使最終體積為2.5 L[29],添加氮、磷營養鹽(終濃度NaNO3為48.5 μmol/L,KH2PO4為3.0 μmol/L)。同時,以無滸苔站位采集樣品作為對照組,相同滸苔暴發狀況的站位作為平行樣。降解過程中,分別于第0、1、2、3、5、10、20、30、60、100、170、230、300天采集樣品,取樣參數包括DOC濃度、FDOM熒光組分和微生物豐度。其中,DOC樣品使用0.7 μm GF/F濾膜(450 ℃預灼燒,5 h)過濾,濾液轉移至40 ml棕色玻璃瓶中,于-20 ℃保存。FDOM樣品使用GF/F濾膜過濾后進一步使用0.2 μm一次性聚醚砜針頭濾器過濾,濾液儲存在20 mL棕色玻璃瓶中,于-20℃保存。微生物豐度(micobial abundance,MA)樣品取1.8 ml海水加入滅菌凍存管(115 ℃,30 min)中,并加入18 μL 50%戊二醛,室溫黑暗條件下固定20 min,使用液氮速凍后于-80℃保存。所有樣品均在取樣后兩周內完成測定。此外,降解體系的溶解氧(DO)使用熒光光纖氧氣測量儀(FireSting O2,Pyro Science)測定,pH使用便攜式多參數分析儀(雷磁,DZB-718-B)測定。

1.3 樣品測定及分析

DOC濃度：使用總有機碳分析儀(Shimadzu,TOC-L CPH)利用高溫催化氧化紅外分析法進行DOC測定[13]。標準溶液使用鄰苯二甲酸氫鉀(KHP),樣品空白使用Milli-Q水,每5個DOC樣品插入1個空白樣品。測定時,首先將DOC樣品常溫避光解凍,再使用6 mol/L HCl酸化樣品至pH=2,每個樣品重復測定3次,精密度為±3%。

FDOM熒光組分及強度：采用三維熒光光譜結合平行因子分析技術(EEMs-PARAFAC)對FDOM主要組分進行分析。使用熒光分光光度計(Hitachi F-4600)測定FDOM樣品的激發-發射矩陣(EEMs),激發波長(Ex)范圍為200～480 nm,發射波長(Em)范圍為250～650 nm,步長為5 nm,掃描速度為1 200 nm/min,掃描信號的積分時間為0.05 s。采用Delaunay三角形內插值法去除瑞利散射和拉曼散射對熒光信號的干擾[30]。為了統一單位,測定1 μg/L硫酸奎寧溶液在Ex=350 nm,Em=450 nm處的熒光值(1 QSU),對所有樣品進行歸一化處理[31]。使用Matlab R2016b軟件和DOM Fluor工具箱通過PARAFAC對EEMs數據進行熒光組分解析。

微生物豐度：使用流式細胞儀(BD FACS Aria II)對微生物豐度進行測定[32]。向990 μL樣品中加入10 μL無菌100×SYBR GREEN I核酸染料[33],黑暗避光染色15 min,加入標準熒光小球作為內參進行測定。

1.4 DOC降解速率常數計算

在DOC降解過程中,利用一階動力學衰減模型對DOC濃度和降解時間進行擬合：

Ct=C0·e-k·t

(1)

式(1)中：C0和Ct分別為第0天和第t天的DOC濃度,t為降解時間,k為降解速率常數(d-1),k值越大,表示DOC的降解速率越快[34]。k的倒數為DOC的周轉時間。

1.5 統計分析

為了探究大量滸苔覆蓋站位和無滸苔站位DOC的生物可利用性差異,使用Sigmaplot 14軟件對不同組的DOC濃度和FDOM熒光組分進行單因素方差分析,顯著性水平為P<0.05。

2 結果

2.1 長期降解過程中DOC濃度及微生物豐度的動態變化特征

在滸苔綠潮大規模暴發時期,大量滸苔覆蓋站位和無滸苔站位表層海水的DOC濃度分別平均為156±12 μmol/L和128±19 μmol/L。并且,溫度分別為21.0±0.5 ℃和20.0±0.9 ℃,鹽度分別為32.0±0.3和31.0±0.8,Chl a濃度分別為0.7±0.1 mg/m3和2.0±1.2 mg/m3?？梢?大量滸苔覆蓋站位的DOC濃度明顯高于無滸苔站位,而Chl a濃度明顯低于無滸苔站位。這暗示了滸苔的暴發在一定程度上抑制了海水中浮游藻類的生長,滸苔站位的高DOC可能大部分來自于滸苔生長向海水中的釋放。

在DOC降解實驗中,為了反映DOC的生物可利用性,我們將DOC廣泛地分為活性DOC(LDOC)和惰性DOC(RDOC)。其中LDOC被定義為在降解過程中呈現快速下降特征,容易被微生物利用或轉化的DOC;而RDOC被定義為在降解過程中表現出強抗降解能力,在系統中可長期保持穩定的DOC。根據DOC的動態變化特征,我們發現DOC降解主要發生在前60 d,這期間滸苔站位和無滸苔站位富集的DOC濃度均呈現快速下降[圖2(a)],大量滸苔組DOC從503±13 μmol/L下降至231±8 μmol/L,無滸苔組DOC從443±3 μmol/L下降至165±11 μmol/L。與此同時,微生物豐度則迅速增加[圖2(b)]。因此,這些被快速消耗的DOC被看作是容易被微生物利用的LDOC,微生物則通過利用這些LDOC從而快速增長至最高豐度。此后,DOC濃度在60～300 d內保持穩定,這些剩余DOC被看作是對微生物降解具有強抵抗力的RDOC。由于這一階段LDOC被耗盡,微生物豐度呈現持續下降并逐漸趨于穩定的特征。同時,利用一階動力學衰減模型對60 d內被消耗的LDOC進行擬合,得到大量滸苔組LDOC的降解速率常數k=0.016 8 d-1,無滸苔組的降解速率常數k=0.019 0 d-1?？梢?對比無滸苔組,大量滸苔組的DOC降解速率稍慢。300 d后,通過計算得到,大量滸苔站位富集的DOC中約46%為RDOC(230/503),而無滸苔組的RDOC比例則顯著降低(P<0.05),為36%(159/443)。由于RDOC可長時間保持穩定,因此RDOC的周轉時間無法通過衰減模型計算獲得[5],但降解體系的RDOC可在長達240 d內保持穩定,推測其在海洋中的周轉時間較長。

圖2 長期降解過程中DOC濃度和微生物豐度的動態變化特征Fig.2 Dynamic changes of DOC and microbial abundance during long-term degradation process

2.2 長期降解過程中FDOM組分的動態變化特征

根據EEMs-PARAFAC分析方法,DOC降解過程中的FDOM主要包含3種熒光組分。其中,C1和C3為類蛋白組分,C2為類腐殖質組分(表1)。在大量滸苔組,與DOC的動態變化類似,FDOM熒光組分的變化特征也主要集中在前60 d,但類蛋白組分和類腐殖質組分呈現完全相反的變化趨勢[圖3(a)]。兩種類蛋白組分(C1和C3)的熒光強度在降解過程中呈現持續下降,表明它們是極易被微生物利用的活性組分,隨著降解的進行被快速消耗或轉化。相反,類腐殖質組分(C2)的熒光強度則隨著降解的進行持續增加,表明它是新產生的RDOC組分,具有強抗降解能力。60 d后,當LDOC組分被耗盡,體系中的FDOM以惰性組分為主,惰性的類腐殖質組分可在60～300 d內保持穩定,進一步證明了體系中剩余的DOC為RDOC。并且,類蛋白組分的逐漸消耗和類腐殖質組分的積累也暗示了體系中的RDOC中除了來自原位海水富集的惰性DOC組分外,還有一部分來自于微生物對活性組分的轉化。在對照組中,無滸苔站位的3種FDOM熒光組分也呈現類似的變化特征,然而類腐殖質組分積累的熒光強度明顯小于大量滸苔組的[圖3(b)],進一步證明了滸苔暴發使海水中含有更多的RDOC。

表1 根據EEMs-PARAFAC方法解析得到的長期降解過程中熒光溶解有機物的主要熒光組分特征Tab.1 Characteristics of the main components of FDOM identified by EEMs-PARAFAC method

圖3 長期降解過程中FDOM熒光組分的動態變化特征Fig.3 Dynamic changes of FDOM components during long-term degradation process

2.3 長期降解過程中DO及pH的動態變化特征

在長期降解過程中,溶液中的pH和DO也呈現出階段性的變化(圖4)。在0～60 d內,隨著LDOC被快速利用,微生物豐度顯著增加,劇烈的微生物呼吸作用導致溶液的DO快速下降,pH值劇烈波動,呈現先快速降低后小幅增加的特征。60 d以后,系統中的LDOC被耗盡,剩余的DOC變得越來越惰性,導致微生物活性逐漸下降,DO和pH也逐漸趨于穩定。在降解后期,降解體系穩定的DO和pH間接反映了剩余RDOC的穩定性。

圖4 長期降解過程中DO和pH的動態變化特征Fig.4 Dynamic changes of DO and pH during long-term degradation process

3 討論

近15年來我國南黃海暴發的滸苔綠潮是世界最大規模的藻華災害之一,目前關于滸苔綠潮的起源、生消特征及給生態環境帶來的負面危害已有大量的報道[42-44],然而關于滸苔綠潮暴發對海洋碳儲庫的影響卻極少關注。當前,在全球氣候變化的嚴峻形勢下,探索滸苔綠潮暴發對近海碳循環的深遠影響至關重要[13]。RDOC由于在海洋中擁有極高的惰性、不容易被微生物轉化及利用,在海洋中的周轉時間可達上千年,被看作是可貢獻于海洋溶解態碳匯的重要碳組分[1,21]。本研究通過探究滸苔綠潮暴發海水和無滸苔海水富集DOC的生物可利用性,發現滸苔暴發海水中的RDOC比例明顯高于非滸苔站位(46%vs36%),暗示了滸苔綠潮暴發在一定程度上可增加近海的RDOC儲庫,貢獻于溶解態碳匯。

在近海生態系統中,大型海藻是初級生產力的重要貢獻者。據統計大型海藻的年凈初級生產力(NPP)高達91～522 g/m2,占全球初級生產的5%～10%[19,45]。并且,大型海藻在生長過程中,可將其初級生產力的18%～62%以DOC的形式釋放到海水中[46],因此,這些藻源DOC的生物可利用性直接決定了其在海洋中的存留時間和對碳儲庫的貢獻。目前,海洋DOC的生物可利用性一般通過特定條件下的生物降解實驗測定,根據其周轉時間不同常分為不同的組分[47-48]。本研究通過長期的微生物降解實驗,發現滸苔綠潮暴發海水的DOC一半以上為LDOC(圖2),它們在微生物的作用下被快速利用,并且有一部分被轉化為RDOC。隨著微生物的利用,FDOM中類蛋白組分逐漸下降、類腐殖質組分逐漸積累(圖3),進一步證明了LDOC向RDOC的轉化。根據海洋微型生物碳泵理論,微生物是RDOC來源中最重要的貢獻者,大約有5%～7%的RDOC來自于微生物對LDOC的轉化[11.49]?？梢?滸苔暴發海水富集后的RDOC組分,和微生物利用LDOC后轉化生成的RDOC組分,共同構成了降解體系最終的RDOC,這些RDOC占滸苔暴發海水富集DOC的46%。

大型海藻一般包含綠藻、褐藻和紅藻,其中綠藻的DOC釋放速率[0～266 μmol/(g·h),干重]遠高于褐藻[0～90 μmol/(g·h),干重]和紅藻[0～41 μmol/(g·h),干重][50]。滸苔作為一種綠藻藻種,可通過光合作用將空氣中的CO2轉化為初級生產力,然后以DOC的形式釋放到海水中。本研究調查的滸苔綠潮爆發站位DOC濃度為156±12 μmol/L,比非滸苔爆發站位DOC高約18%。這與以往的調查結果類似,2017年針對滸苔綠潮爆發的研究指出,滸苔綠潮爆發海水的DOC濃度(平均值約89 μmol/L)顯著高于非滸苔海區,大約高1.2倍[20]。本研究通過長期的DOC降解實驗表明,滸苔綠潮海水中的DOC近一半(46%)為RDOC。因此,滸苔綠潮暴發除了顯著增加海水中的DOC濃度,還可在一定程度上貢獻于近海的RDOC庫積累。然而,本研究是在通過實驗室模擬條件下獲得,忽略了海流、溫度變化、光化學分解等因素的影響。并且,C18固相萃取的方法優先萃取海洋中的極性分子,導致部分非極性分子缺失。因此,本實驗結果與現場真實狀況有一定的差別,后續需要更多的現場調查及圍隔實驗加以驗證。

4 結論

本研究通過DOC的長期微生物降解實驗,探究了滸苔綠潮暴發海水DOC的生物可利用性,證明了滸苔綠潮暴發在一定程度上可貢獻于近海RDOC儲庫的積累。主要結論為：

(1)經過微生物對DOC的長期降解,大量滸苔覆蓋海水的RDOC比例(46%)明顯高于無滸苔海水,證明了滸苔綠潮暴發可增加海水的RDOC含量。

(2)通過解析DOC的長期微生物降解過程中FDOM的熒光組分變化,發現部分LDOC可在微生物的作用下轉化為RDOC,證明了微生物在RDOC產生中扮演著重要角色。